方龍發(fā)， 王小奇， 束長龍， 宋福平， 黃 勃， 張 杰＊

（1.安徽省微生物防治省重點實驗室，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

自從1981年第一個Bt cry類基因被克?。?]，目前已克隆出771個Bt cry類基因（http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk／home／Neil－Crickmore／Bt／）。由于其具有對非靶標(biāo)害蟲無毒，對環(huán)境安全等特點［1－2]，而廣泛用于轉(zhuǎn)基因作物［3]。隨著轉(zhuǎn)cry1A 類基因作物的大面積種植［4－5]，害蟲對Cry1A類蛋白產(chǎn)生了抗性［6－7]，而Cry9類蛋白與Cry1A類蛋白無交互抗性［8]，因此cry9類基因具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，已發(fā)現(xiàn)36個cry9類基因（http：∥www.lifesci.sussex.ac.uk／home／Neil－Crickmore／Bt／）。在第三等級上分為13類：cry9Aa、cry9Ba、cry9Bb、cry9Ca、cry9Da、cry9Db、cry9Ea、cry9Eb、cry9Ec、cry9Ed、cry9Ee、cry9Fa、cry9Ga，其中Cry9Bb蛋白對煙草天蛾（Manduca sexta）、大豆黧豆毛蟲（Velvetbean caterpillar）［9]等有活性；Cry9Ca蛋白對云杉卷葉蛾（Choristoneura fumiferana）［10]、夜小卷蛾（Epinotia aporema）［11]、煙草天蛾（Manduca sexta）［12]、歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）［13]等有殺蟲活性，Cry9Eb、Cry9Ee和 Cry9Ec蛋白對小菜蛾［14－15]有活性，而 Cry9Aa蛋白對亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）［8]、小 菜 蛾［16]、大 蠟 螟 （Galleria mellonella）、歐洲松帶蛾（Thaumetopoea pityocampa）［17]、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）［18]等多種鱗翅目害蟲具有殺蟲活性，應(yīng)用價值較高。cry9Aa3是本實驗室從Bt菌株SC5D2中分離而來，對小菜蛾和亞洲玉米螟有較高活性，且與Cry1Ac蛋白無交互抗性［8]，是抗蟲轉(zhuǎn)基因作物理想的候選基因。

研究表明，在轉(zhuǎn)Bt基因的過程中，全長的cry類基因表達(dá)水平較低，截短的片段表達(dá)水平較高［19－20]。因此，當(dāng)Bt基因用于轉(zhuǎn)化植物之前，確定其最小活性區(qū)是十分必要的。國內(nèi)外對Cry蛋白最小活性區(qū)的研究報道已經(jīng)很多，主要包括兩種方法：1）通過截短的方法確定最小活性區(qū)，如Cry1Ah蛋白（最小活性區(qū)位于50I與639E之間）［21]、Cry1Ba3蛋白（最小活性區(qū)位于22M～655L之間［22]、Cry1Ie1最小活性區(qū)位于活性區(qū)位于45M～648E之間［23]；2）蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化，純化后再進(jìn)行N端測序，如Cry2Aa經(jīng)酶解后形成50kDa片段［24]；Cry1Ac的最小活性區(qū)位于28R與623K之間［25－26]。

本文研究了Cry9Aa3蛋白12種不同長度的片段對小菜蛾和亞洲玉米螟的最小活性區(qū)域，為Cry9Aa殺蟲機(jī)理研究以及cry9Aa的商業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

Rosetta（DE3）（Stratagene）、SC5D2菌株（含有cry9Aa3的重組菌株）、pEB載體（氨芐抗性T7啟動子）。

1.2 序列分析和引物設(shè)計

根據(jù)cry9Aa3序列（GenBank登錄號：GQ249293），用DNAMAN分析工具獲得翻譯蛋白序列，提交于二級預(yù)測 網(wǎng) 站 （http：∥www.biogem.org／tool／choufasman／）預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，并用SWISS－MODEL在線建模工具模擬Cry9Aa3蛋白的三級結(jié)構(gòu)，綜合考慮二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，設(shè)計如下幾對引物（表1）。在線（http：∥web.expasy.org／compute＿pi／）分析各截短片段的PI值和分子量，并用Harrison兩個參數(shù)的統(tǒng)計學(xué)模型預(yù)測重組蛋白表達(dá)的可溶性［27]。

表1 引物序列及酶切位點Table 1 DNA sequences of primers and restriction enzyme sites on the primers

1.3 基因的擴(kuò)增、克隆及序列的測定

以菌株SC5D2質(zhì)粒DNA為模板，利用Primerstar高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性10min，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)。將回收純化的PCR產(chǎn)物克隆到pEB載體［28]，篩選出正確的陽性轉(zhuǎn)化子并測序（北京華大基因有限公司）。

1.4 Cry9Aa截短蛋白的表達(dá)和SDS－PAGE分析

將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Rosetta（DE3）在菌體 A600nm為0.5 時，加入終濃度為1.0mmol／L IPTG，16 ℃、150r／min誘導(dǎo)12h進(jìn)行表達(dá)。在4℃、12 000g離心收集菌體，用20mmol／L Tris－HCl（pH 8.0）緩沖液懸浮細(xì)胞并進(jìn)行超聲波破碎（美國SonicsVCX500），超聲條件：功率70%，超聲10min（處理5s停5s）。然后分別將可溶組分和不可溶組分進(jìn)行SDS－PAGE分離。蛋白電泳樣品制備與SDS－PAGE電泳檢測參見Sambrook等的方法［29]。

1.5 生物活性的分析

供試?yán)ハx：小菜蛾（Plutella xylostella）由本實驗室提供；亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）由綻諾思特公司提供。

對于有活性的截短蛋白，選取蛋白終濃度為0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9μg／g 作 為 生 測濃度，對于喪失活性的截短蛋白，選取200μg／g作為生測濃度，并以只有pEB載體Rosetta菌株作為陰性對照。亞洲玉米螟生測［30]使用人工飼料，小菜蛾［28]生測使用甘藍(lán)菜葉。生測數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件計算LC［31]。

50

2 結(jié)果與分析

2.1 信息學(xué)結(jié)果

2.1.1 序列特征

Cry9Aa3蛋白存在3個保守結(jié)構(gòu)域，即Domain I由N端第60～290位共231個氨基酸組成；Domain II由第295～508位共214個氨基酸組成；DomainⅢ由第513～655位共143個氨基酸組成。因此，其最小活性區(qū)可能位于60V～655V。

2.1.2 預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)

預(yù)測該蛋白的N端二級構(gòu)型應(yīng)該是α－螺旋，α′－2螺旋與三級結(jié)構(gòu)所預(yù)測的α－1螺旋存在疊合區(qū)域（圖1）。據(jù)此，推測α′－2螺旋可能會影響該蛋白的活性，而45位氨基酸是α′－2螺旋的起始氨基酸（圖1），它可能對維持蛋白活性有重要作用，它的缺失可能會引起蛋白活性的喪失。β′－1折疊與預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)的β－23折疊基本重合，只在C端有一個氨基酸的差異（655位）。

圖1 Cry9Aa3蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 The predicted secondary structure of Cry9Aa3toxin

2.1.3 預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)

根據(jù) SWISS－MODEL 預(yù) 測 的 三 級 結(jié) 構(gòu)，Cry9Aa3蛋白3個結(jié)構(gòu)域位于54D與655V之間（圖2）。最終，根據(jù)以上預(yù)測結(jié)果，確定了44、45、46、54、60、70、652、653、654、655、700共11個截短位點。

圖2 Cry9Aa3三級預(yù)測結(jié)構(gòu)（SWISS－MODEL）Fig.2 The predicted 3Dstructure of Cry9Aa3 toxin（SWISS－MODEL）

2.2 不同截短片段的克隆與檢測

按表2中的引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到不同長度的cry9Aa3的基因片段（圖略）。將PCR產(chǎn)物酶切消化后分別與pEB載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選出正確的陽性克隆，并提取質(zhì)粒。

2.3 表達(dá)的片段及其性質(zhì)分析

不同長度的cry9 Aa3基因在Rosetta菌株中都有表達(dá)（圖3、4），根據(jù)不同蛋白的分子量（表2），可知Cry9Aa3－1～700蛋白比Cry9Aa3－1～1151截短蛋白小，而比其他的截短片段大，而其他的截短片段之間分子量差異很小，這與圖2中蛋白大小趨勢符合。此外，所有截短蛋白分子量都比經(jīng)胰蛋白酶消化后所形成的片段大（圖4）。根據(jù)表2中CV－CV′值，所有截短蛋白的CV－CV′＞0，這時，P 表示不可溶性概率，P值越大表示該蛋白在過表達(dá)時，不可溶的可能性越大，而表2中截短蛋白相對全長蛋白P值小，說明截短蛋白的可溶性優(yōu)于全長蛋白。據(jù)此，可能會得到上清表達(dá)量較高的截短蛋白，而圖4中的Cry9Aa3－1～654、Cry9Aa3－1～655蛋白上清表達(dá)量明顯高于全長蛋白，符合預(yù)測的結(jié)果。

表2 不同截短蛋白的特性分析1）Table 2 Characterization of different truncated fragments of Cry9Aa3protein

圖3 SDS－PAGE分析Cry9Aa3各截短蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)（沉淀）Fig.3 SDS－PAGE analysis of the truncated Cry9Aa3polypeptides expressed in E.coli

2.4 不同截短蛋白的生物活性

不同長度Cry9Aa3截短蛋白對小菜蛾和亞洲玉米螟的生物活性見表3。

表3 不同長度Cry9Aa3截短蛋白對小菜蛾和亞洲玉米螟的生物活性測定結(jié)果Table 3 Bioassay results of different expression products against the larvae of P.xylostellaand O.furnacalis

表3中陽性對照Cry9Aa3－1～1151對小菜蛾（LC502.63μg／g）和亞洲玉米螟（LC505.34μg／g）的毒力都較高，且截短蛋白Cry9Aa3－1～700、Cry9Aa3－1～654、Cry9Aa3－1～655、Cry9Aa3－44～700、Cry9Aa3－45～700對小菜蛾和亞洲玉米螟的毒力與陽性對照差異不顯著（P＞0.05），而截短蛋白Cry9Aa3－1～653、Cry9Aa3－1～652、Cry9Aa3－46～700、Cry9Aa3－54～700、Cry9Aa3－60～700、Cry9Aa3－70～700對小菜蛾和亞洲玉米螟幾乎喪失活性。因此，可以確定，Cry9Aa3蛋白對小菜蛾和亞洲玉米螟的最小活性區(qū)位于45I～654P之間。

3 討論

1991年，第一個cry9Aa基因就被克?。?2]，但至今關(guān)于Cry9Aa蛋白機(jī)理研究的文章難覓，主要原因可能是Cry9Aa蛋白的表達(dá)存在問題。Cry9Aa蛋白在Bt無晶體突變體中不表達(dá)，在大腸桿菌中主要是以包涵體的形式存在，在上清中表達(dá)量極低（未發(fā)表資料），無法純化和用于殺蟲機(jī)理研究。本研究通過可溶性預(yù)測模型［27]對各截短片段的可溶性進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)截短蛋白相對于全長蛋白，其可溶性的概率提高，說明其上清表達(dá)量比全長蛋白高。所有Cry9Aa3截短蛋白上清表達(dá)量都高于Cry9Aa3全長蛋白表達(dá)量（圖4），其中Cry9Aa3－1～654、Cry9Aa3－1～655蛋白相對其他截短蛋白可溶性比例提高最為顯著，與預(yù)測結(jié)果相符，這為推進(jìn)Cry9Aa蛋白的機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。本研究還發(fā)現(xiàn)截短的Cry9Aa3蛋白的pI值為8.1左右，而Cry2Ab4蛋白的預(yù)測pI值為8.73（http：∥web.expasy.org／compute＿pi／），這兩者同屬于弱堿性蛋白，它們是否存在相似的殺蟲機(jī)制，以及Cry2Ab的晶體輔助蛋白是否能輔助Cry9Aa3截短蛋白在HD73無晶體突變株表達(dá)，這些都值得進(jìn)一步探索。

目前，已有9種Cry／Cyt蛋白的晶體結(jié)構(gòu)被解析，如CrylAa、Cry2Aa、Cry3Aa、Cry4Aa等［33－36]。由于Cry9Aa蛋白與現(xiàn)在已解析三維空間結(jié)構(gòu)的Cry蛋白的氨基酸序列相似性低（30%左右），在同源建模的過程中無合適的模板，故所建模型準(zhǔn)確度較低（ERRAT http：∥services.mbi.ucla.edu／SAVES／，得分為44.874）。因此，本研究綜合考慮三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，設(shè)計700、655、654、653、652、54、60、70、46、45、44十一個截短位點，在C端截至654位氨基酸時有活性，而截至653位時喪失活性，結(jié)合圖2，655位氨基酸的缺失并不影響DomainⅢ的β－23結(jié)構(gòu)的完整性；而654位氨基酸的缺失會影響DomainⅢ的β－23結(jié)構(gòu)的完整性［37]，這說明 DomainⅢ中的β－23折疊片，是保持DomainⅢ功能所不可缺少的部分，這與Cry1Ba截短試驗的結(jié)論一致［22]。而在N端截至45位時，該截短蛋白有活性，而截至46位時，其活性喪失，根據(jù)預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果，46位氨基酸是α′－2螺旋的起始氨基酸，截去該氨基酸會影響此螺旋的完整性，再結(jié)合預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)結(jié)果，二級結(jié)構(gòu)的α′－2螺旋應(yīng)該是三級結(jié)構(gòu)的α－1螺旋，說明α－1螺旋是維持蛋白殺蟲活性的重要結(jié)構(gòu)。這與某些蛋白的結(jié)論相似，如Cry1AMod毒素，它缺失α－1螺旋，影響其對敏感昆蟲的殺蟲活性［38]；而與另一些蛋白的結(jié)論相矛盾，如Cry2Aa蛋白和Cry5Ba蛋白，它們都缺失α－4螺旋前的所有區(qū)域，仍然具有殺蟲活性［24，39]。綜上所述，α螺旋對蛋白活性的影響與蛋白的種類有關(guān)，今后需要更多的實驗證據(jù)來驗證。

本研究最小活性區(qū)的確定為高效多價工程菌和轉(zhuǎn)基因作物的研制創(chuàng)造了有利條件，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

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