修云芳，王全溪，邵良平，李碧春，徐素慧，陳玉村

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2.海峽（福州）大熊貓研究交流中心，福建福州350001；3福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

肥大細(xì)胞（mast cells，MCs）來源于骨髓造血干細(xì)胞，通常分布于皮膚下層、呼吸道、消化道黏膜以及黏膜下的血管、淋巴管周圍的結(jié)締組織中［1］。據(jù)報(bào)道，卵巢MCs的數(shù)量與分布因發(fā)情周期不同而呈規(guī)律性改變，研究表明這些細(xì)胞參與卵巢功能的局部調(diào)節(jié)［2］。在生理?xiàng)l件下，MCs內(nèi)有相當(dāng)量的組胺。據(jù)報(bào)道，發(fā)情前期大鼠與倉(cāng)鼠卵巢肥大細(xì)胞及脫顆粒數(shù)量增加導(dǎo)致卵巢組胺含量增加。有研究表明熱應(yīng)激導(dǎo)致肥大細(xì)胞數(shù)量與組胺含量同時(shí)增加［3］。MCs衍生物—組胺參與刺激排卵、卵巢的血液循環(huán)及毛細(xì)血管通透性改變。

雄性哺乳動(dòng)物，由于精原干細(xì)胞（germline stem cells，GSCs）的存在，精子發(fā)生可以貫穿整個(gè)生命周期。自從20世紀(jì)50年代始，以美國(guó)科學(xué)家Zuckerman提出的哺乳動(dòng)物卵巢“固定卵泡庫(kù)”理論占主導(dǎo)地位，認(rèn)為哺乳動(dòng)物雌性配子的發(fā)生僅出現(xiàn)于胚胎發(fā)育期，出生后卵巢中生殖細(xì)胞已發(fā)育到了原始卵泡階段，并停止于第一次減數(shù)分裂的雙線期，之后這些卵泡凋亡或者待休眠一段時(shí)間后重新啟動(dòng)發(fā)育，雌性哺乳動(dòng)物出生后沒有卵子再生［4］。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)成年哺乳動(dòng)物的卵巢內(nèi)存在雌性生殖干細(xì)胞（female germline stem cells，F(xiàn)GSCs）且能生成新的卵母細(xì)胞［5－6］。

小鼠脈管同系物（mouse vasa homolog，MVH）是果蠅vasa基因的同源類似物，其編碼產(chǎn)物是一個(gè)DEAD 家族的RNA 解旋酶。MVH 首先從小鼠的PGC中克隆出來，隨后在各階段的生殖細(xì)胞中均檢測(cè)到了其表達(dá)，MVH 基因缺陷型小鼠的生殖細(xì)胞出現(xiàn)分化停滯和凋亡現(xiàn)象，同時(shí)Oct4基因的表達(dá)水平也隨之降低，小鼠失去生殖能力。因此MVH 作為一個(gè)在生殖細(xì)胞發(fā)育中起重要作用的基因，被公認(rèn)為是生殖細(xì)胞的特異標(biāo)志基因。小熊貓卵巢組織學(xué)結(jié)構(gòu)已有報(bào)道［7］，但無小熊貓卵巢FGSCs、MCs及組胺分布的報(bào)道。本研究收集15例不同時(shí)期小熊貓卵巢，觀察其中FGSCs及肥大細(xì)胞分布與數(shù)量，為了解MCs在小熊貓生殖過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 15只來自福州某地的因非生殖系統(tǒng)疾病死亡的小熊貓。按照動(dòng)物所處不同生理周期將卵巢樣本分組：發(fā)情期4個(gè)，乏情期7個(gè)，妊娠期4個(gè)。

1.1.2 主要試劑 甲苯胺藍(lán)、阿爾新藍(lán)Alcian blue 8GX、番紅花紅Safranine O 為上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品；鼠抗組胺抗體為美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；鼠抗MVH 抗體、兔抗小鼠IgG1為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集與處理 將卵巢切成約1.5cm×1.5cm×0.5cm 大小組織塊，浸泡在40mL／L福爾馬林中，4℃保存4h。按常規(guī)組織學(xué)技術(shù)制備石蠟切片，以5μm 厚度半連續(xù)切片。

1.2.2 肥大細(xì)胞染色 組織塊貯存在Carnoy’s固定液，甲苯胺藍(lán)染色呈現(xiàn)MC 顆粒異染特征。石蠟切片脫蠟至水，用甲苯胺藍(lán)浸泡30s，然后用雙蒸水洗3min兩次，950mL／L 乙醇分色，在顯微鏡下觀察直至MCs呈現(xiàn)紫紅色顆粒出現(xiàn)便停止分色，在乙醇中快速脫水后置二甲苯中透明，中性樹膠封片。

AB－S染色：切片脫蠟復(fù)水，然后在3.6g／L Alcian blue 8GX 和0.18g／L Safranine O 的醋酸鈉－鹽酸緩沖液（pH 1.42）中染色30 min，在乙醇中快速脫水后置二甲苯中透明，中性樹膠封片。

1.2.3 組胺陽性（histamine－positive）細(xì)胞及小鼠脈管同系物（MVH）－陽性細(xì)胞免疫組化染色 切片常規(guī)脫蠟至水，30 mL／L 的H2O2室溫5 min～10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，50 mL／L 即用型正常山羊血清培養(yǎng)0.5h，然后在含0.2mL／L的TritonX－100、0.1mL／L的Bsat和鼠抗組胺抗體（稀釋度為1∶400）（或者小鼠抗MVH 抗體）磷酸buffer液（pH7.0）4℃過夜孵育，PBS 漂洗后，兔抗小鼠IgG1室溫孵育1h，抗生物素蛋白－生物素－過氧化物酶結(jié)合物中室溫孵育1h。用PBS沖洗切片3 次，DAB顯色，PBS沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，蓋玻片封片。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 卵巢樣本按取材動(dòng)物的生理周期，分為發(fā)情期，乏情期與妊娠期3組。每個(gè)樣本選5張切片，使用LEICAR 2800 顯微鏡40×10 倍觀察，每張切片觀察5個(gè)視野。統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野MCs平均數(shù)。采用SPASS11.0 軟件單因素方差分析和Fisher最小顯著差異檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)期小熊貓卵巢中MCs分布情況

小熊貓卵巢中單位視野下MCs數(shù)量，妊娠期平均4.18±0.34個(gè)，乏情期平均8.39±0.39，發(fā)情期11.08±0.70。不同時(shí)期MCs數(shù)量差異極顯著（P＜0.01）。數(shù)量與分布隨著發(fā)情周期呈規(guī)律性變化，發(fā)情期最高，乏情期次之，妊娠期數(shù)量最少（圖1）。

2.2 小熊貓卵巢MCs的形態(tài)與類型

小熊貓卵巢MCs呈圓形，橢圓形或者不規(guī)則形（圖2A）。苯甲胺藍(lán)染色呈異染性，胞質(zhì)中充滿紫色粗糙顆粒，細(xì)胞核小，呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中間或偏于一側(cè)。MCs分布在血管壁或者卵泡周圍的結(jié)締組織中。發(fā)情期與乏情期它們大多分布在皮質(zhì)區(qū)與卵泡周圍（圖2A、2C），發(fā)情期MCs較乏情期（圖2B）與妊娠期大。AB－S染色異染顆粒呈藍(lán)色的為黏膜型（圖2D）；異染顆粒呈紅色的結(jié)締組織型（圖2E）；異染顆粒呈紅藍(lán)間染色的為混合型（圖2F）。

圖1 小熊貓不同周期卵巢肥大細(xì)胞數(shù)量Fig.1 Number of ovary mast cells in the different cycle of red panda

2.3 小熊貓卵巢組胺陽性細(xì)胞形態(tài)與分布

檢測(cè)到小熊貓卵巢有組胺陽性細(xì)胞存在，其分布規(guī)律呈周期性變化，陽性細(xì)胞形態(tài)大，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核呈圓形位于細(xì)胞中間，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量組胺陽性顆粒（圖2G）。乏情期的卵巢組胺陽性細(xì)胞數(shù)量較少，形態(tài)小，呈圓形（圖2H）。發(fā)情期的卵巢組胺陽細(xì)胞數(shù)量多。妊娠期卵巢組胺陽性細(xì)胞較大，呈橢圓形，但是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的陽性顆粒明顯較少（圖2I）。

2.4 小熊貓卵巢中MVH 的表達(dá)

小熊貓卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞呈MVH 陽性，我們?cè)谏成掀?nèi)也發(fā)現(xiàn)了MVH 陽性細(xì)胞，我們認(rèn)為這些細(xì)胞可能是FGSCs（圖3）。

3 討論

圖2 小熊貓卵巢肥大細(xì)胞及組胺表達(dá)Fig.2 Mast cells and expression of histamine in red panda ovaries

圖3 小熊貓卵巢MVH 陽性表達(dá)Fig.3 Positive expression of MVH in the ovary of red panda

MCs是機(jī)體組胺的主要來源，MCs以旁分泌的方式參與許多內(nèi)分泌腺體如卵巢、甲狀腺、腎上腺和睪丸的局部調(diào)節(jié)。發(fā)情周期卵巢中MCs的數(shù)量與分布變化規(guī)律表明這些細(xì)胞參與卵巢功能的局部調(diào)節(jié)。體外試驗(yàn)表明，MC 脫顆粒作用和MC 誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素8與卵泡發(fā)育和排卵有關(guān)［8］。大鼠卵巢髓質(zhì)MCs數(shù)量在發(fā)情期最多，乏情期次之，發(fā)情前期數(shù)量最少，MCs在發(fā)情前期脫顆粒。發(fā)情前期倉(cāng)鼠卵巢MCs數(shù)量最低，同時(shí)脫顆粒及組胺水平增加。牛的卵巢發(fā)情前期（Day 19）優(yōu)勢(shì)卵泡內(nèi)的MCs數(shù)量增加與卵泡發(fā)育有關(guān)，MCs數(shù)量降低與排卵有關(guān)。閆金坤等［9］研究發(fā)現(xiàn)，摘除卵巢導(dǎo)致小鼠小腸MCs顯著減少，而適量補(bǔ)充雌二醇可在一定程度上增加MCs的數(shù)量。小熊貓卵巢MCs數(shù)量呈規(guī)律性變化，發(fā)情期最高，乏情期次之，妊娠期最少。小熊貓乏情期血清雌二醇維持在低水平，發(fā)情期血清雌二醇處于高水平，排卵后降至基礎(chǔ)水平［10］。本試驗(yàn)未能同時(shí)監(jiān)測(cè)小熊貓血清中雌二醇的濃度，但本研究初步顯示小熊貓卵巢MC 數(shù)量與發(fā)情周期雌二醇濃度密切相關(guān)，MCs可能對(duì)小熊貓的受精、胚胎著床和妊娠有調(diào)節(jié)作用。

研究表明，GSCs與卵原細(xì)胞分布在卵巢上皮與皮質(zhì)區(qū)，在胎兒卵巢中，卵母細(xì)胞位于原始卵泡邊緣。20世紀(jì)50年代早期，形成了關(guān)于哺乳動(dòng)物出生卵母細(xì)胞池就形成且不能再生的理論，該理論限制了卵巢功能不全及因老年化或疾病導(dǎo)致不育的治療。出生后小鼠卵巢中有生殖細(xì)胞增殖與卵泡更新，卵巢表面大的呈卵圓形的生殖細(xì)胞可能是GSCs。成年小鼠的卵巢中存在罕見的雌性生殖干細(xì)胞。與成年雄性哺乳動(dòng)物睪丸精原干細(xì)胞維持精子生成類似，這些細(xì)胞能產(chǎn)生新的卵母細(xì)胞［11］。用抗MVH 抗體免疫組化法鑒定FGSCs，發(fā)現(xiàn)生殖上皮內(nèi)有MVH 陽性細(xì)胞，據(jù)此我們認(rèn)為成年小熊貓卵巢內(nèi)有FGSCs，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)將為小熊貓繁殖生物技術(shù)提供理論支持。

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