王秀禎，羅永芳，夏文君，羅雪剛，彭少靜，周 念，李繼祥

（西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶402460）

鴨疫里默桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一種不運動、無芽胞的革蘭陰性菌，主要感染2周齡～8周齡鴨，病死鴨以纖維素性心包炎、肝周炎及氣囊炎為主要特征［1］。該菌是當前危害養(yǎng)鴨業(yè)最重要的病原菌之一，可使鵝、火雞、雞［2］等多種家禽及野鳥感染發(fā)病。RA 全基因組序列分析發(fā)現，有多種胞外蛋白酶基因且菌株間高度保守［3－5］。胞外蛋白酶作為病原性細菌的重要毒力因子，具有溶組織、抗吞噬和促進細菌擴散等多種作用，是多種細菌的保 護 性 抗 原 之 一，且 不 具 有 血 清 型 特 異 性［6－8］。Pathanasophon P等［9］發(fā)現，RA 肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液（鋁膠佐劑）可以誘導小鴨獲得對攻毒的保護；我們在前期進行比較基因組學研究中發(fā)現，自然弱毒RA－DY9株［10］缺失胞外蛋白酶membrane－associated zinc metalloprotease（mazp）基因（資料未發(fā)表）。為探索RA 各血清型菌株共同的保護性抗原，本研究對鴨疫里默桿菌胞外蛋白酶基因mazp進行原核表達，并通過動物試驗測定表達蛋白的免疫原性。

1 材料與方法

1.1 材料

RA－AF 株（血 清2 型）、RA－BSY 株（血 清1型），試驗感染鴨能引起典型的“三炎”［11］；RA－DY9株，對14 日齡鴨無毒力的自然弱毒株［10］。E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、pET－32a（＋）、RA－AF株細菌抗血清、RA－AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清由西南大學榮昌校區(qū)獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究室保存；pMD19－T Vector、PCR 試 劑、DNA 膠 回 收 和DNA 連接試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產品；His－Bind樹脂為德國Merck公司產品；Western blot試劑盒為加拿大BioBasic公司產品。5 日齡、12日齡花邊鴨由重慶永健生物技術有限公司實驗動物基地提供。

1.2 方法

1.2.1 mazp基因的克隆 參照GenBank 已發(fā)表的RA－GD 株mazp基因核苷酸序列（CP002562.1），利用引物設計軟件設計1 對上、下游引物（P1：5′－GGATCCGATTTGTTAACCCAAAT－3′，P2：5′－AAAGCTTAATGTCACTTCCAATAATGAG－3′），在上、下游引物的5′端分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，預計擴增片段大小為1 326bp左右，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

按照參考文獻［12］利用SDS／CTAB 法提取RA－AF 株細菌基因組DNA。以提取的基因組DNA 為模板擴增目的基因片段。PCR 反應體系（25.0μL）：基因組DNA 1.0μL，10×PCR buffer（Mg2＋free）2.5μL，dNTPs（各2.5 mmoL／L）2.0μL，MgCL2（25mmoL／L）2.0μL，上、下游引物（10μmoL／L）各2.0μL，TaKaRa r Taq（5 U／μL）0.25μL，加水至總體積為25.0μL。PCR 擴增程序：95 ℃3 min；95 ℃1 min，49 ℃1 min，72 ℃1.5min，30個循環(huán)；72 ℃10 min。10g／L 的瓊脂糖凝膠電泳觀察，利用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收PCR 產物，純化產物與pMD19－T 載體在經16 ℃過夜連接，轉化E.coli DH5α，藍白斑篩選陽性克隆并擴大培養(yǎng)后寄上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果在NCBI中利用Blast進行比對分析。

1.2.2 原核表達載體的構建及誘導表達 利用最小堿裂解法提取含mazp基因的重組質粒和原核表達質 粒pET－32a（＋），并 分 別 利 用HindⅢ 和BamHⅠ在30 ℃水浴中作用2h 進行雙酶切；10g／L瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收mazp基因和線性化pET－32a（＋）并用T4DNA 連接酶連接后轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞；陽性重組表達質粒轉化E.coli BL21（DE3），IPTG（1 mmol／L）誘導菌液用SDS－PAGE進行重組蛋白的檢測。表達融合蛋白按說明書用His.Bind樹脂進行純化及用RA－AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清進行Western blot檢測。

1.2.3 mazp蛋白免疫小鴨的攻毒保護試驗 mazp蛋白經純化后利用生理鹽水配置成0.6mg／mL，按1∶2（V／V）與礦物油佐劑（柏油、司班、硬脂酸鋁）乳化為油包水的免疫抗原。88只5日齡鴨隨機分成8組，每組11只；第1組、第2組每只鴨頸部皮下接種免疫抗原0.5 mL（免疫原蛋白含量0.2 mg／mL），第3組、第4組每只免疫油包水RA－AF株全菌抗原0.5mL（免疫原細菌含量1.0×1010cfu／mL），第5組、第6組每只免疫油包水pET－32a（＋）標簽蛋白（免疫原蛋白含量0.2mg／mL），第7組、第8組為空白對照組；免疫后15d，第1組、第3組、第5組、第7組小鴨用RA－AF 株菌懸液經腿部皮下接種0.2mL／只（100LD50），第2組、第4組、第6組、第8組接種RA－BSY 株0.2mL／只（100LD50）；攻毒后連續(xù)觀察10d，記錄發(fā)病及死亡情況。

1.2.4 mazp蛋白抗血清的被動免疫保護試驗 用1.2.3制備的mazp蛋白和標簽蛋白免疫抗原分別免疫健康家兔制備抗血清，免疫程序為：第1次背部皮下多點注射1.5mL／只，每間隔14d進行一次加強 免 疫，第2 次 免 疫2.0 mL／只，第3 次 免 疫3.0mL／只。第3次免疫后14d采血分離血清用于被動免疫保護試驗。88只12日齡鴨隨機分成8組，每組11 只；第1 組、第2 組每只鴨頸部皮下注射mazp蛋白抗血清2.0mL，第3、4組注射RA－AF株細菌抗血清2.0mL，第5、6組注射標簽蛋白抗血清2.0mL，第7、8組注射生理鹽水作對照組。注射血清后24h，第1 組、第3 組、第5 組、第7 組用RAAF 株菌懸液經腿部皮下接種0.2mL／只（100LD50），第2、第4、第6、第8組接種RA－BSY 株0.2mL／只（100LD50）；攻毒后連續(xù)觀察10d，記錄發(fā)病及死亡情況。

1.2.5 數據處理 按Sandhu的方法［13］計算保護指數（PI），并進行卡方檢驗。

2 結果

2.1 鴨疫里默桿菌mazp基因的擴增

瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，以RA－AF株細菌基因組DNA 為模板擴增獲得一條介于1 000bp～2 500bp的DNA 條帶（圖1）。將純化的擴增產物克隆、測序得到1 326bp的核苷酸序列。該序列在核苷酸和氨基酸水平與 RA－ATCC 11845（CP003388.1）和RA－GD（CP002562.1）株mazp 基因的相似性均在99%以上。

圖1 RA－AF株細菌mazp基因的PCR 結果Fig.1 PCR result of mazp gene of RA－AF strain

2.2 mazp基因的原核表達

利用pET－32a（＋）構建的重組表達載體pET－32a－mazp 轉 入E.coli BL21（DE3），并 經IPTG（1mmoL／mL）在37℃誘導5h，表達蛋白以包涵體形式存在。包涵體經尿素變性，利用His.Bind樹脂純化獲得mazp 蛋白（圖2）。Western blot結果顯示，mazp蛋白能與RA－AF株肉湯培養(yǎng)物無菌濾液鼠抗血清發(fā)生特異性反應（圖3）。

圖2 SDS－PAGE檢測重組蛋白Fig.2 Detection of recombinant protein by SDS－PAGE

圖3 重組蛋白Western blot檢測Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein

2.3 攻毒保護

試驗鴨經免疫抗原免疫15d后的攻毒保護結果見表1。mazp 蛋白抗原免疫動物經RA－AF 株（血清2型）細菌攻毒的死亡率和保護指數分別為27.3%和62.4，RA－BSY 株（血清1型）攻毒的死亡率和保護指數分別為18.2%和77.8，二者死亡率間的差異不顯著（X2＝0.009）。

表1 主動免疫鴨的攻毒保護試驗Table 1 Protection of ducks by active immunization against challenge with RA

在抗血清的被動免疫保護試驗中，注射mazp蛋白抗血清動物在RA－AF和RA－BSY 株細菌攻毒后第5天開始發(fā)病，第7天開始死亡，注射標簽蛋白抗血清和空白對照在攻毒后第2天開始發(fā)病及第3天開始死亡。mazp蛋白抗血清對RA－AF和RA－BSY的攻毒保護指數分別為45.5和27.3，二者間差異不顯著（P＞0.05）（表2）。

表2 被動免疫鴨的攻毒保護試驗Table 2 Protection of ducks by passive immunization against challenge with RA

3 討論

RA 感染對我國養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴重，在使用化學藥物的情況下，許多養(yǎng)鴨場的發(fā)病率仍超過50%、病死率在80%以上。疫苗免疫預防已被證實在RA感染防控中是有效的，但現有菌體疫苗具有型特異性，在生產中廣泛使用受到限制［14］。因此，不具有型特異性的保護性抗原是今后RA 疫苗研究需要重點解決的問題。隨著RA－GD［3］、RA－MY［4］和RAATCC11845［5］等全基因組序列的測定及各基因的功能注釋，為研究不同血清型菌株共同保護性抗原提供了新的思路。本文在前期研究發(fā)現自然弱毒RA－DY9株缺失胞外蛋白酶基因mazp的基礎上研究原核表達mazp蛋白的免疫原性，是探索RA 各血清菌株共同保護性抗原的一次有益嘗試。

mazp蛋白是一種不具有型特異性的保護性抗原，但不具有完全免疫保護作用。RA－AF肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液中除有部分在培養(yǎng)過程中死亡溶解菌體結構成分外，主要是細菌在生長繁殖過程中分泌的可溶性成分，胞外蛋白酶就是其中之一。由于沒有純化RA 胞外蛋白酶mazp及制備抗血清，本文用肉湯培養(yǎng)物的無菌濾液抗血清替代進行Western blot。Western blot結果顯示，表達mazp蛋白具有反應原性。在主動免疫保護試驗中，mazp蛋白免疫鴨獲得攻毒保護指數（PI）在60以上，無血清型間的差異；在被動免疫保護試驗中，mazp蛋白抗血清能延緩攻毒動物的發(fā)病和死亡時間、降低發(fā)病率和死亡率。胞外蛋白酶為病原性細菌合成并分泌到細胞外的非結構成分，其抗體僅能通過影響蛋白酶自身來實現抑制細菌擴散和對組織的損傷等，對菌體無影響，這是mazp蛋白抗原在動物試驗中不具有完全保護作用的原因。在今后RA 疫苗研究工作中，應將mazp蛋白與其他結構成分聯(lián)合使用以提高免疫保護率。

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