吳嬡瓊，謝芝勛，胡庭?。?，謝麗基，羅思思，鄧顯文，謝志勤，黃 莉，黃嬌玲，曾婷婷

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西獸醫(yī)研究所畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科A 型流感病毒屬的禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種禽類的感染／疾病綜合征，主要引起禽類的全身或呼吸系統(tǒng)疾?。?］。AIV亞型眾多，根據(jù)表面糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性差異，已鑒別出16 種HA 亞型（H1－H16）和9 種NA（N1－N9）亞型［1］；根據(jù)AIV 致病力的差異可分為高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HP－AIV）和低致病性禽流感病毒（Lowly pathogenic avian influenza virus，LP－AIV）［2］。HP－AIV 引起的家禽AI以全身感染、高發(fā)病率和高死亡率為特征。LP－AIV 引起的家禽AI臨床癥狀表現(xiàn)溫和，病死率不高，但影響家禽的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能。

H4亞型AIV 屬于LP－AIV，能隱性感染各種家禽及野生鳥類［3］，宿主范圍比較廣，包括雞、火雞、鴨、野鴨、野鳥、鴕鳥、鸚鵡等，還可以跨物種傳播，感染哺乳動(dòng)物［4］。薛峰等［5］報(bào)道，在江蘇鹽城國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)對(duì)野鴨、丹頂鶴等野禽AIV 檢測(cè)中，H4亞型AIV 分離率最高（38.5%）。雖然絕大多數(shù)LP－AIV 致病力低，但LP－AIV 可能為感染人類的AIV 提供基因［6］，潛在危害性不容忽視。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)H4亞型AIV 的監(jiān)測(cè)。

目前，國內(nèi)建立的AIV 快速檢測(cè)方法多數(shù)都是針 對(duì) 其 他 亞 型AIV，如H1、H3、H5、H6、H7、H9［7－11］亞型，而針對(duì)H4亞型AIV 的快速檢測(cè)方法未見報(bào)道。所以，本研究建立的H4亞型AIV 的套式RT－PCR 方法，旨在為H4亞型AIV 的臨床監(jiān)測(cè)提供有效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 5株H4亞型AIV、其他AIV 亞型（H1、H3、H6、H9）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、禽呼腸病毒（ARV）及雞毒支原體（MG）由廣西獸醫(yī)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；H5、H7亞型AIV RNA由美國賓夕法尼亞州立大學(xué)惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 SPF 雞胚為北京梅里亞公司產(chǎn)品；DNA／RNA 試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑、dNTP 和2×Taq PCR Mix為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)H4 亞型AIV 的HA 基因核苷酸序列的保守區(qū)域，應(yīng)用生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0 設(shè) 計(jì) 并 篩 選 了2 對(duì) 特 異 性 引物，即外引物和內(nèi)引物（表1）。其中，外引物擴(kuò)增目的片段為342bp，內(nèi)引物擴(kuò)增目的片段為199bp。引物由Invitrogen公司合成。

表1 外引物和內(nèi)引物序列Table 1 The sequence of inner and outer primers

1.1.4 病毒 RNA 的抽提與反轉(zhuǎn)錄 參照DNA／RNA 抽提試劑盒使用說明書抽提病毒RNA 和ILTV 及MG DNA，用隨機(jī)引物將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于－30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 套式RT－PCR條件的優(yōu)化 2次PCR 均為25μL反應(yīng)體系，其他體系組分不變（2×PCR Master Mix 12.5μL、模板2μL），分別針對(duì)引物濃度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。第1輪PCR 擴(kuò)增，外 引 物 上、下 游 引 物 各0.1 μL ～0.5 μL（25.0pmol／μL）范圍，循環(huán)數(shù)15、18、21、25、30.5個(gè)梯度，退火溫度50℃～60℃優(yōu)化反應(yīng)體系。第2輪PCR 以第1輪PCR 產(chǎn)物10倍倍比稀釋物為模板，優(yōu)化第2輪PCR 反應(yīng)模板濃度，引物濃度、反應(yīng)循環(huán)數(shù)及退火溫度優(yōu)化同第1輪。

1.2.2 特異性試驗(yàn) 用本研究建立的套式RTPCR 方法，同時(shí)擴(kuò)增H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9亞型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG 和ARV 的核酸，以超純水作為陰性對(duì)照，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)15g／L 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.3 敏感性試驗(yàn) 測(cè)定H4亞型AIV RNA 的濃度，并按10倍倍比稀釋H4亞型AIV RNA，其濃度分別為3.6ng／μL、360、36.0、3.60pg／μL、360、36.0、3.6fg／μL。對(duì)各濃度的病毒RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，分別進(jìn)行普通RT－PCR 和套式RT－PCR 擴(kuò)增，并設(shè)陰性對(duì)照，PCR 產(chǎn)物經(jīng)15g／L瓊脂糖凝膠電泳，觀測(cè)結(jié)果。

1.2.4 臨床樣品檢測(cè) 將106份從廣西南寧市活禽市場(chǎng)采集的口腔和泄殖腔拭子進(jìn)行RNA 提取，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用本試驗(yàn)建立優(yōu)化好的套式RT－PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，重復(fù)3次，保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。對(duì)106份樣品進(jìn)行抗生素處理，用雞胚分離病毒，用傳統(tǒng)的病毒血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 套式RT－PCR條件優(yōu)化結(jié)果

本試驗(yàn)經(jīng)過對(duì)套式RT－PCR 條件的優(yōu)化，最后確定最佳的反應(yīng)條件為：兩輪的反應(yīng)體系都是25μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，2μL cDNA，引物 上、下 游 各0.2 μL（25 pmol／μL），加 純 水 至25μL。第1 輪 反 應(yīng) 模 式 為：95 ℃5 min；95 ℃50s，55 ℃40s，72 ℃1 min，21 個(gè) 循 環(huán)；72 ℃10min，12 ℃結(jié)束反應(yīng)。第2輪反應(yīng)模式為：95 ℃5min；95 ℃50s，56 ℃40s，72 ℃1min，21個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)入72℃延伸10min，12℃結(jié)束反應(yīng)。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)15g／L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，第1輪特異性擴(kuò)增產(chǎn)物大小為342bp，與預(yù)期結(jié)果相符；第2輪特異性擴(kuò)增產(chǎn)物大小為199bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

將各病原體待檢測(cè)的cDNA 進(jìn)行套式RTPCR 特異性擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電脈結(jié)果表明只在H4亞型AIV 的cDNA 處出現(xiàn)了大小199bp的目的條帶，其他病原體的cDNA 與陰性對(duì)照都無條帶出現(xiàn)（圖2）。說明本試驗(yàn)建立的套式RT－PCR 檢測(cè)方法具有良好的特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，普通RT－PCR 最低能檢測(cè)到36pg／μL的病毒含量（圖3）。而套式RT－PCR最低能檢測(cè)到360fg／μL的病毒含量（圖4）。經(jīng)比較，套式RT－PCR比普通RT－PCR 靈敏性高100倍。

2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

在廣西南寧市活禽市場(chǎng)106 份樣品中，套式RT－PCR 檢測(cè)結(jié)果有3份呈H4亞型AIV 陽性（圖5）；病毒分離鑒定結(jié)果為3份陽性樣品。表明所建立的套式RT－PCR 檢測(cè)結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致。

圖1 套式RT－PCR 優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The optimization results of nested RT－PCR

圖2 套式RT－PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The specificity assay of nested RT－PCR

圖3 常規(guī)RT－PCR 的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensitivity assay of conventional RT－PCR

圖4 套式RT－PCR 的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The sensitivity assay of nested RT－PCR

圖5 套式RT－PCR的臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The detection results of clinical samples by nested RT－PCR

3 討論

AIV 是一種高度接觸性、急性傳染病，可引起感染家禽從呼吸系統(tǒng)病變到全身敗血的癥狀。自首次發(fā)現(xiàn)AIV 以來的100 多年里，世界各地不斷有AI的暴發(fā)和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。H4亞型AIV 屬于低致病禽流感病毒，多從水禽和野鳥體內(nèi)分離到，在鴨、鵝和野鳥等體內(nèi)持續(xù)存在，且可能傳播給雞［12］。并且，H4亞型AIV 廣泛分布于世界各地，許多國家都分離到H4亞型AIV，在中國也分離到了H4亞型AIV。因此，加強(qiáng)對(duì)H4亞型AIV 檢測(cè)和鑒別具有很重要的意義。

本研究通過H4亞型AIV HA 基因比對(duì)分析，設(shè)計(jì)并篩選了2對(duì)特異性引物，針對(duì)H4 亞型AIV模板進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增，通過對(duì)反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，建立了H4亞型AIV 套式RT－PCR 方法。用本研究所建立的套式RT－PCR 方法，對(duì)H1、H3、H4、H5、H6、H7、H9 亞型AIV、NDV、IBV、ILTV、MG 和ARV 的 核 酸 進(jìn) 行 擴(kuò) 增，結(jié) 果 該RT－PCR 方法只能擴(kuò)增H4亞型AIV，而對(duì)其他亞型AIV 及禽呼吸道疾病病原體不擴(kuò)增，表明該P(yáng)CR 方法具有高度特異性；用本研究所建立的套式RT－PCR 方法和常規(guī)RT－PCR 方法分別進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果套式RT－PCR 方法較常規(guī)RT－PCR 方法更敏感。對(duì)活禽市場(chǎng)106份樣品分別用本研究建立的套式RT－PCR方法進(jìn)檢測(cè)和傳統(tǒng)的病毒血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定，兩者結(jié)果一致。綜上所述，本研究建立的套式RT－PCR 方法特異性強(qiáng)、敏感性好、精確度高，為監(jiān)測(cè)H4亞型AIV 提供了有效的檢測(cè)方法。

套式RT－PCR 是在常規(guī)RT－PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展和改良而來的。常規(guī)RT－PCR 是通過1對(duì)引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，套式RT－PCR 比常規(guī)RT－PCR 增加了1對(duì)引物，這對(duì)引物結(jié)合在第1次PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部，通過兩輪擴(kuò)增，建立套式RT－PCR檢測(cè)方法。與常規(guī)RT－PCR 相比，套式RT－PCR 具有以下兩方面的優(yōu)勢(shì)：①當(dāng)樣品模板量低時(shí)，常規(guī)RT－PCR可能檢測(cè)不到樣品，套式RT－PCR 通過第2輪在第1輪PCR 產(chǎn)物內(nèi)部進(jìn)一步擴(kuò)增，可增加檢測(cè)的敏感性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，避免漏檢陽性樣品。經(jīng)過本研究敏感性試驗(yàn)的驗(yàn)證，表明所建立的套式RTPCR 比常規(guī)RT－PCR 敏感性高出100倍；②客觀來說，一對(duì)引物不是萬能的，當(dāng)非特異性擴(kuò)增不能完全避免的時(shí)候，如第1輪擴(kuò)增產(chǎn)生了非特異性片段，第2輪不能在第1輪PCR 產(chǎn)物上繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增，提高了套式RT－PCR的特異性。值得注意的是，由于第2輪PCR 擴(kuò)增的模板是第1輪的擴(kuò)增產(chǎn)物，最好對(duì)第1輪產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，避免第1輪的引物殘留，影響第2輪擴(kuò)增，因此，本研究經(jīng)過對(duì)其優(yōu)化，確定第1輪的產(chǎn)物需稀釋100倍后作為第2輪的模板，達(dá)到了很好的PCR 擴(kuò)增效果。此外，在套式RT－PCR 操作過程中，應(yīng)注意防止模板和擴(kuò)增產(chǎn)物污染，因而模板加入、擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋和PCR 反應(yīng)體系配制（包括第1輪和第2輪）應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，并加入陰性對(duì)照進(jìn)行比較，從而保證試驗(yàn)的精確性。雖然套式RTPCR 需進(jìn)行2 次PCR 反應(yīng)，但每次的反應(yīng)時(shí)間相比，較于普通RT－PCR均縮短了1倍左右，總體反應(yīng)時(shí)間與普通RT－PCR 相同，但套式RT－PCR 方法特異性更強(qiáng)、敏感性更好、精確性更高。

本研究建立的H4 亞型AIV 套式RT－PCR 方法具有精確性高、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)，為H4亞型AIV 的快速檢測(cè)提供了方法，對(duì)有效防控H4亞型AIV 有重要意義，為AIV 的監(jiān)測(cè)和快速診斷提供了方法，具有良好的應(yīng)用前景。

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