成欣然，顏潤川，胡新德，宋玲珍，張 偉，張亞妹，陳樹林，趙善廷

（西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌712100）

RSP3（radial spoke protein 3）是一個與鞭毛微管組裝相關的基因，于1989年首次在衣藻中被克隆出來，衣藻pf14突變體由于缺少RSP3而發(fā)生鞭毛組裝缺陷［1］。衣藻鞭毛外周微管與中心微管之間以放射輻相連，衣藻pf14突變體由于缺少RSP3蛋白而導致整個放射輻不能組裝，因此推測RSP3可能直接與微管相結合，起到錨定整個放射輻的作用［2］。衣藻鞭毛放射輻起著從中心微管向外周微管傳遞信號的作用，放射輻缺陷突變體對外界環(huán)境更為敏感，如Ca2＋濃度和cAMP 濃度等［3］。人們以衣藻為材料，通過RⅡblot overlays試驗證明RSP3是一個A 型 激 酶 錨 定 蛋 白（A－kinase anchoring protein，AKAP），進一步分析發(fā)現RSP3 就是AKAP97［4］。AKAPs是功能上相關的調節(jié)蛋白家族，具有結合PKA 的保守區(qū)和引導AKAP－PKA 復合體到亞細胞位點的靶向區(qū)，AKAP不僅與PKA 相互作用，也與其他信號分子作用。

衣藻RSP3在小鼠中的同源基因于2004 年首次被克隆出來，其在小鼠基因組中的總跨度為230kb，由8個外顯子和7個內含子組成，通過原位雜交技術研究發(fā)現，小鼠RSP3大量表達于神經系統(tǒng)中，然而其在細胞內的分布特點和功能尚不清楚［5］。酵 母 雙 雜 交 試 驗 表 明，RSP3 作 為 一 個AKAP，能 與ERK1／2 結 合，從 而 有 可 能 整 合ERK1／2與PKA 信號通路［6］。AKAP－PKA 復合體可匯集和整合來自各種通路的信號，該復合體不僅可局部增強cAMP 和其他信號，還可以通過降低PKA 的基礎活性，發(fā)揮遠程效應。

哺乳動物的纖毛和真核生物的鞭毛在結構上是一致的，哺乳動物纖毛結構缺陷可導致多種疾病，如生殖能力降低，視覺、嗅覺、聽覺的減退，呼吸系統(tǒng)易感染，肝腎的多囊性增生等［7－8］。RSP3作為纖毛結構的重要組成部分，對維持纖毛結構的完整性至關重要，提示RSP3可能參與多種信號通路，與多種疾病密切相關。然而，目前有關哺乳動物中RSP3的研究甚少。本研究通過對多個物種RSP3蛋白氨基酸序列進行比對分析，并對其功能域進行預測，初步推測其功能及定位。為了進一步研究其可能的功能，構建了小鼠RSP3 的GFP 融合表達載體，轉染CHO 細胞，對RSP3與微管進行共定位研究。同時將RSP3－GFP 轉 染CHO 細 胞 后 用 KEDL 和GM130分別標記內質網和高爾基體。我們發(fā)現RSP3－GFP并不定位于內質網或高爾基體，而是聚集于胞質中。以上結果表明在哺乳動物細胞中RSP3并不能直接與微管結合，也不分布于內質網或高爾基體等細胞器，而是聚集在細胞核周圍的胞質中，這為進一步深入研究RSP3在哺乳動物中的功能奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 C57BL／6J小鼠購自西安交通大學，飼養(yǎng)于西北農林科技大學超凈鼠房，3月齡開始交配，以可見陰道栓開始記為E0.5（embryo day 0.5），到E18.5時取胚胎腦組織用于提取RNA。中國 倉 鼠 卵 巢 細 胞 系 （Chinese hamster ovary，CHO）、pCAG－MCS－GFP空載體（由pCAG－MCS載體經BglⅡ單酶切后加入GFP 編碼序列改造而成）和Escherichia coli DH5α菌種由西北農林科技大學神經生物學實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內切酶BamH Ⅰ、HindⅢ、BglⅡ及T4DNA 連接酶、pGEM－T Easy載體、質粒提取試劑盒、DNA 回收試劑盒為Promega公司產品；反轉錄試劑盒為Fermentas公司產品；X－tremeGENE HP 轉 染 試 劑 為Roche 公 司 產品；TRIzol及總RNA 提取相關試劑、胎牛血清、F－12K Nutrient Mixture、DMEM、Opti－MEM、胰蛋白酶、HEPES、青霉素、鏈霉素為Life Technology 公司產 品；mouse anti－GM130、mouse anti－GAPDH、donkey anti－mouse－HRP為Sigma公司產品；mouse anti－KDEL 為Santa cruz公 司 產 品；DAPI、mouse anti－α－tubulin、donkey anti－mouse－568 為Millipore公司產品；引物合成及DNA 測序由南京金斯瑞生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取與反轉錄 按照Life Technology公司RNA 提取試劑盒上的說明書操作步驟提取組織樣品總RNA，經超微量分光光度計測定RNA濃度后，保存于－80 ℃冰箱備用。取總RNA 各2.5μg進行反轉錄，反轉錄體系為：總RNA 2.5μg，5×Reaction buffer 4 μL，Oligo（dT）2 μL，10mmol／L dNTPs 1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，RT－Enzmye 1μL，用DEPC水補足20μL。42 ℃反應1h，70 ℃5min滅活，保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠RSP3 基因克隆 根據NCBI公布的RSP3 基 因 序 列 號（GenBank Accession Number NM 025789.5）及pCAG－MCS表達載體酶切圖譜設計RSP3特異性引物，在上、下游分別加入BamHⅠ和HindⅢ兩個酶切位點，并加入保護性堿基（下劃線部分），在上游引物中加入GCCACC 基序。上游引 物 RSP3－F：5′－GGATCCGCCACCATGGCCGCCACCAACATTTG－3′；下游引物RSP3－R：5′－AAGCTTGGCTCTGCCATAAGGTGTCCC－3′。以E18.5小鼠腦組織提取的RNA 反轉錄得到的cDNA 為模板進行PCR，得到RSP3基因片段。

1.2.3 RSP3 真核表達載體構建 PCR 產物經電泳后用DNA 凝膠回收試劑盒回收純化，將回收產物與pGEM－T Easy載體連接，并轉化大腸埃希菌DH5α，取100μL 轉化產物均勻涂布于預先涂有5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D 半乳糖苷（5－bromo－4－chloro－3－indolylβ－D－galactopyranoside，X－gal）和 異 丙 基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（isopropylβ－D－1－thiogalactopyranoside，IPTG）的含有100 mg／L 氨芐青霉素的LB 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落，180r／min，37 ℃搖床上振蕩培養(yǎng)過夜進行擴增，菌液PCR 和酶切鑒定后挑選陽性克隆送南京金斯瑞生物技術有限公司測序。將測序結果與NCBI上公布的序列比對分析，將完全正確的克隆命名為pGEM－T－RSP3。將pGEM－T－RSP3 菌種擴大培養(yǎng)后 提 取 質 粒，對pGEM－T－RSP3 和pCAG－MCSGFP質粒用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，回收產物在T4DNA 連接酶作用下于16 ℃連接過夜。連接產物轉化入E.coli DH5α感受態(tài)細菌，轉化的菌液涂布于含100 mg／L 卡那霉素的LB 平板上培養(yǎng)，次日挑取單克隆，菌液PCR 和酶切鑒定后挑選陽性克隆送至金斯瑞生物技術有限公司進行測序，將獲得的正確克隆命名為pCAG－RSP3－GFP。

1.2.4 RSP3序列分析與蛋白結構預測 根據NCBI上發(fā)布的多物種RSP3核苷酸和氨基酸序列（表1），通過DNA Man軟件分析RSP3 核苷酸和氨基酸序列，分析RSP3在進化中的保守序列，同時通過Smart軟件預測RSP3可能存在的結構域。

表1 GenBank中不同物種RSP3核酸和蛋白序列號Table 1 Nucleotide and protein numbers of RSP3in different organisms from GenBank

1.2.5 CHO 細胞培養(yǎng)及轉染 在細胞培養(yǎng)皿中加入適量的F12－K 細胞培養(yǎng)液并接種CHO 細胞，混勻后置于37 ℃、體積分數為5%CO2的條件下培養(yǎng)，轉染前將CHO 細胞傳代至提前放有細胞爬片的24孔細胞培養(yǎng)板中，待其匯合度達70%左右用X－tremeGENE HP轉染試劑進行轉染，操作按照XtremeGENE HP轉染試劑說明書進行。

1.2.6 細胞免疫熒光染色 將轉染后24h的細胞取出，用40mL／L的多聚甲醛溶液固定30 min，經1mL／L Triton X－100 透化、10 mL／L 的羊血清 封閉后，用0.1mol／L PB 洗滌3次，每次10min。在不同樣品中分別加入mouse anti－α－tubulin、mouse anti－KDEL、mouse anti－GM130，4 ℃過 夜 孵 育，0.1mol／L PB沖洗3次，每次15min，然后加入Alexa Fluor 568donkey anti－mouse IgG 熒 光 標 記 二抗，室溫孵育3h。加入1μg／mL DAPI對胞核進行染色，室溫下孵育3min，0.1 mol／L PB 沖洗3 次，每次15min，染色結束后用抗熒光淬滅劑（Dako）封片，置于蔡氏倒置熒光顯微鏡下拍照觀察分析。

2 結果

2.1 RSP3 基 因 擴 增 及pCAG－RSP3－GFP 表 達 載體構建

以小鼠胚胎18.5d（E18.5）腦組織提取RNA，經反轉錄得到cDNA 模板，PCR 擴增RSP3基因，產物經10g／L瓊脂糖凝膠電泳，在約1 500bp處出現特異性擴增條帶，陰性對照組（以水為模板）未見擴增條帶（圖1）。將目的片段回收后連接pGEM－T Easy載體，轉化大腸埃希菌中擴增，提取pGEM－TRSP3質粒用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，得到預期的2個條帶，3 100bp左右的為pGEM－T Easy載體片段，1 500bp 左右的為RSP3 基因片段（圖2），回收RSP3 基因片段與同樣雙酶切的pCAGMCS－GFP載體連接。重組質粒載體pCAG－RSP3－GFP經BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，電泳檢測得到2個條帶，5 800bp左右的條帶為pCAG－MCS－GFP載體，1 500bp左右的條帶為RSP3基因片段（圖3）。

2.2 RSP3序列分析及蛋白結構預測

用DNA Man軟件將小鼠的RSP3氨基酸序列與NCBI上公布的其他物種的RSP3氨基酸序列進行比對，結果表明小鼠RSP3氨基酸序列與大鼠、獼猴、人類、斑馬魚和非洲爪蟾的RSP3氨基酸序列同源性 分 別 為86.9%、76.1%、66.1%、61.7%和61.1%（圖4A）。這些物種的RSP3氨基酸序列比對發(fā)現有一段進化過程中高度保守序列，這段序列有可能與RSP3的功能密切相關（圖4B）。用SMART軟件對小鼠的RSP3蛋白結構域進行預測，預測結果表明在RSP3的N－端有一個Coil－coil結構域，中間部分為RSP3結構域，其余部分無明顯結構域（圖4C）。

圖1 RSP3基因PCR 擴增電泳分析Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR products

圖2 重組質粒雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid pGEM－T－RSP3

圖3 重組質粒pCAG－RSP3－GFP酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of pCAG－RSP3－GFP

圖4 RSP3序列分析及蛋白結構預測Fig.4 Sequence analysis and domain prediction of mouse RSP3

2.3 RSP3在CHO 細胞中表達

小鼠RSP3是衣藻RSP3的同源基因，在衣藻中RSP3可與鞭毛微管結合，通過SMART 軟件預測分析發(fā)現小鼠RSP3有一個RSP3結構域。為了研究哺乳動物RSP3 是否直接與微管結合，通過培養(yǎng)CHO 細胞，制作細胞爬片并轉染pCAG－RSP3－GFP重組質粒。轉染后24h用PFA 固定，用tubulin單克隆抗體標記微管，在熒光顯微鏡下可見在CHO 細胞中微管作為骨架分布于整個細胞，但RSP3－GFP并不與微管相結合，而是呈聚集狀態(tài)分布于細胞內（圖5F），GFP 對照組呈均勻彌散的分布狀態(tài)（圖5C）。進一步分析其分布特點發(fā)現，RSP3－GFP主要分布在細胞核的周圍，聚集成有一定體積的顆粒。

2.4 RSP3在CHO 細胞中的分布特點

在CHO 細胞中RSP3并未與微管相結合，而其分布形態(tài)與細胞內膜系統(tǒng)相似，為了進一步研究RSP3在細胞中的亞定位，本試驗通過不同的細胞器特異性標記抗體對RSP3進行亞細胞定位。pCAGRSP3－GFP重組質粒轉染CHO 細胞后，用KDEL抗體對內質網進行標記，用GM130抗體對高爾基體進行標記，結合RSP3－GFP綠色熒光，在熒光顯微鏡下觀察RSP3在CHO 細胞中的亞定位。在熒光顯微鏡下可觀察到RSP3－GFP 綠色熒光信號并不與KDEL紅色熒光信號重合，而是比KDEL 分布更集中更靠近細胞核（圖6）。高爾基體特異性標記GM130與RSP3－GFP也不重合，而是呈現出一定的交錯狀態(tài)，即RSP3－GFP空隙處正好有GM130標記信號，而且GM130 信號分布在細胞核的一端，而RSP3－GFP環(huán)繞細胞核的周圍都有分布（圖7）。以上結果表明RSP3聚集分布于胞質中，而且不與內質網及高爾基體結合。

圖5 小鼠RSP3重組蛋白在CHO 細胞中表達Fig.5 The expression of RSP3in CHO cells

圖6 熒光雙標RSP3和內質網Fig.6 Co－label of RSP3－GFP and endoplasmic reticulum

圖7 RSP3與高爾基體共定位分析Fig.7 Co－label of RSP3－GFP and Golgi apparatus

3 討論

RSP3于1989年首次在衣藻中被克隆，并被證明是一個鞭毛相關蛋白，參與鞭毛的組裝，然而其在小鼠中的同源基因一直到2004年才被首次克隆出來［1，5］。在 衣 藻 中，RSP3 作 為 一 個AKAP 通 過 與PKA 全酶的RⅡ亞基的RⅡa區(qū)域結合而局域化調控PKA，調節(jié)纖毛和鞭毛的運動［4］。在進化過程中，高等植物基本上已經失去了纖毛和鞭毛結構，但哺乳動物卻保留了纖毛。哺乳動物的纖毛分為可動纖毛和原始纖毛?？蓜永w毛主要分布于肺上皮、輸卵管、室管膜及精子鞭毛，為“9＋2”結構，主要與運動相關，而原始纖毛幾乎存在于所有細胞，為“9＋0”結構，主要與細胞感受外界環(huán)境及信號傳遞相關［9］。哺乳動物RSP3是否也是纖毛的結構蛋白，是否也參與纖毛運動的調控及相關信號轉導，在進化過程中其功能發(fā)生了哪些變化，目前尚無相關研究。

通過氨基酸序列比對分析發(fā)現，小鼠RSP3 與衣藻RSP3在結構上有些不同，這可能是在進化過程中該基因的功能發(fā)生了改變。哺乳動物中RSP3的N－端比衣藻多出127個氨基酸，而其功能尚不清楚，也許是進化過程中對其功能的補充。蛋白結構預測結果表明，在RSP3的N－端有一個Coil－coil結構域，中間部分為RSP3結構域，其余部分無明顯結構域。Coil－coil結構功能多樣，在不同的蛋白中其功能往往不同，而RSP3結構域是一個可能與微管結合的結構域，由此可推測RSP3有可能與微管相結合。衣藻RSP3通過其N－端的RSP3結構域結合于放射輻上，這提示我們在哺乳動物細胞中RSP3 也可能與微管相結合。我們通過表達小鼠RSP3與微管共定位，發(fā)現其并不與微管結合，微管分布于整個細胞，構成網狀結構的骨架，而RSP3聚集分布于細胞內。其繞核分布的特點提示我們，RSP3可能錨定于內質網或是高爾基體上。本研究通過內質網特異性Maker KDEL和高爾基體特異性Maker GM130，將RSP3與內質網或高爾基體共定位，結果表明RSP3并未錨定于內質網或是高爾基體上，而是以聚集狀態(tài)分布于細胞質中。

在衣藻中的研究表明，RSP3能與多種蛋白相結合組成放射輻，從中心鞘向外周二聯(lián)體微管傳遞信息調節(jié)鞭毛的運動，在衣藻RSP3的PKA 結合結構域突變體中，由于RSP3不能與PKA 結合而導致運動障礙［10－11］。在錐蟲中的研究表明，RSP3還參與調節(jié)動力蛋白的運動從而調節(jié)細胞分裂過程，有學者通過酵母雙雜交的方法證明RSP3能與ERK1／2結合，表明RSP3可能參與了細胞分裂的信號傳遞或是通過纖毛感覺外界環(huán)境的變化調節(jié)細胞分裂的過程［6，12］。纖毛或鞭毛運動的調節(jié)是通過動力蛋白的磷酸化和去磷酸化來調節(jié)的，而RSP3 作為一個AKAP，在動力蛋白磷酸化調節(jié)及纖毛運動過程中扮演者非常重要的角色［13］。衣藻RSP3有兩個兩親結構域，形成一個同源二聚體，能與含有Dpy－30結構域的蛋白互作［14］。這些結果提示我們RSP3可能不僅僅是一個纖毛的組成結構，還可能參與了多種信號的傳遞和整合。

本研究首次通過在哺乳動物細胞中表達RSP3，研究其分布特點和可能的功能，結果表明，哺乳動物RSP3與衣藻相比存在著一些相同之處，也存在著很大的差異，這可能是在進化過程中其功能發(fā)生了一定的改變。在CHO 細胞中表達RSP3 后發(fā)現其聚集程度很高，可能為蛋白多聚體，而衣藻中RSP3只是形成二聚體，聚集程度相對很低。哺乳動物細胞更為復雜，功能更多樣，哺乳動物RSP3 與衣藻RSP3蛋白結構的差異性和保守性可能決定了其功能的差異性與相似性。衣藻中RSP3與多種蛋白互作，那么在哺乳動物中相對應的同源基因間是否存在互作，哺乳動物大多數細胞保留了纖毛結構，RSP3是否也構成哺乳動物纖毛的結構成分，這些都還有待進一步研究。本研究通過構建RSP3表達載體，并在CHO 細胞中表達，探討了哺乳動物RSP3的基本性質和在細胞中的表達及定位情況，為研究RSP3在進化過程中的功能演變提供了一定的線索，也為進一步深入研究其在哺乳動物細胞和機體內的功能奠定了基礎。

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