陳陽

重癥肌無力屬于一種因傳遞功能障礙（神經(jīng)-肌肉接頭處）所致的自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為骨骼肌無力（部分或全身）、易疲勞，癥狀在活動后加重，經(jīng)過休息后癥狀減輕。該病患病率在77/100萬~150/100萬，年發(fā)病率在4/100萬~11/100萬，可發(fā)生在任何年齡段，以1~5歲兒童多見。臨床治療該病方法較多，但療效不夠理想，尚無公認標(biāo)準治療方案[1]。從發(fā)病機制方面研究，重癥肌無力發(fā)生、進展中T細胞、胸腺起到重要作用，出現(xiàn)自身免疫性疾病和抑制性的T細胞活性下降，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)性的T細胞亞群失衡，致使B細胞過多產(chǎn)生自身抗體相關(guān)[2]。所以，治療重癥肌無力應(yīng)考慮對T細胞亞群進行調(diào)節(jié)，使之平衡。胸腺五肽是由五種氨基酸（酪氨酸、纈氨酸、天門冬氨酸、賴氨酸、精氨酸）組成。誘導(dǎo)T細胞分化是其作用之一，具有免疫調(diào)節(jié)功能。對于免疫力低下者，動物整體實驗或離體實驗證實，胸腺五肽可誘導(dǎo)T細胞分化，使外周T淋巴細胞活化，具有免疫調(diào)節(jié)活性[3]。本研究以免疫熒光技術(shù)檢測胸腺五肽對重癥肌無力小鼠T淋巴細胞亞群產(chǎn)生的影響，并與其他組別對照，以分析胸腺五肽對重癥肌無力的藥效，現(xiàn)具體報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 選取30只雌性小鼠（C57BIJ6），8周齡，平均體重（19.55±1.24）g（提供單位：北京市維通利華動物有限公司）。將所有小鼠隨機分為治療組（2 d給1次藥）、模型對照組、正常對照組，每組各10只。合成多肽（26肽鏈），TP-5序列（提供單位：深圳翰宇生物有限公司）。完全福氏佐劑（提供單位：美國Sigma公司）。BBC裂解液（提供單位：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。黏片劑，一抗CD4、CD8，二抗（提供單位：天津灝洋生物有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥情況 所有小鼠均在清潔級條件下進行喂養(yǎng)管理，治療組免疫成為重癥肌無力模型后，給藥操作為胸腺五肽，0.25 mg/次（藥液容積0.5 mL），2 d給1次藥，持續(xù)用藥2周；模型對照組免疫成為重癥肌無力模型后，給藥操作以等量生理鹽水代替藥物；正常對照組的免疫、給藥操作均以等量生理鹽水代替藥物[4-5]。

1.2.2 建立重癥肌無力模型 制備第1次免疫注射乳劑，把20 μg合成多肽（26肽鏈）溶于100 mL PBS緩沖液（pH 7.2），加入等量完全弗氏佐劑，混合充分直至油滴吸附油滴吸附全部水溶液。第1次選取背部6處和兩后肢墊，每處注射20 μL，選取尾基部注射40 μL。制備第2次免疫注射乳劑，把20 μg合成多肽（26肽鏈）溶于50 mL PBS緩沖液（pH 7.2），加入等量完全弗氏佐劑，混合充分直至油滴吸附油滴吸附全部水溶液。在第1次注射4周后進行第2次注射，選取背部3處每處注射20 μL，選取尾基部注射40 μL。重癥肌無力癥狀通常會在注射2周后出現(xiàn)[6-7]。

1.2.3 提取T細胞 內(nèi)眥取血1 mL，置入離心管（5 mL）中，4 ℃環(huán)境靜置30 min，以3000轉(zhuǎn)速離心10 min，去血清。將RBC裂解液（1.5 mL）加入到沉淀血細胞內(nèi)，翻轉(zhuǎn)混勻，在15 ℃環(huán)境靜置15 min，期間進行1~2次混勻，以2500轉(zhuǎn)速離心10 min，去清液；以PBS溶液反復(fù)洗滌，以2500轉(zhuǎn)速離心10 min，直到沉淀內(nèi)紅色消失。加入PBS溶液（100 μL），制成T細胞懸液，4 ℃環(huán)境靜置備用[8]。

1.2.4 CD4+、CD8+細胞計數(shù) 取T細胞懸液（5 μL）均勻涂到載玻片（已加粘片劑）上，晾干。在載玻片上滴加固定劑，2~3 min后，以PBS溶液洗滌，之后晾干。載玻片上加一抗后，置于濕盒內(nèi)，37 ℃環(huán)境培養(yǎng)30 min，以PBS溶液洗滌，之后晾干。載玻片上加二抗后，置于濕盒內(nèi)，37 ℃環(huán)境培養(yǎng)30 min，以PBS溶液洗滌，之后晾干。以掃描顯微鏡（Univar）分光光度計拍照，以配套軟件對CD4+、CD8+細胞計數(shù)[9]。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x-±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組免疫后用藥治療前體重比較 三組免疫后用藥治療前體重如下：治療組為（21.42±1.53）g，模型對照組為（21.38±1.46）g，正常對照組為（19.91±1.30）g。與正常對照組比較，治療組和模型對照組的體重均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 三組T淋巴細胞亞群中CD4+、CD8+細胞計數(shù)、比值比較 在免疫、用藥治療后，CD4+（%）結(jié)果：正常對照組<治療組<模型對照組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；CD8+（%）結(jié)果：治療組<正常對照組<模型對照組，但三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；CD4+/CD8+比值結(jié)果：正常對照組<治療組<模型對照組，與模型對照組比較，正常對照組和治療組比值接近，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 三組T淋巴細胞亞群中CD4+、CD8+細胞計數(shù)、比值比較（x-±s）

3 討論

胸腺生成素Ⅱ中的胸腺五肽為其活性中心，具有其所有活性，胸腺五肽和胸腺生成素Ⅱ一樣，具有雙向免疫調(diào)節(jié)的功能，使T細胞內(nèi)CD4+/CD8+比值保持在合理范圍內(nèi)。重癥肌無力屬于自身免疫性疾病，有細胞免疫依賴性補體參與，胸腺內(nèi)T淋巴細胞（nAChR致敏）參與周圍循環(huán)，通過白細胞介素、腫瘤壞死因子、Y-干擾素等細胞因子，導(dǎo)致nAChR抗體在B細胞中產(chǎn)生。本實驗中，在實驗小鼠體內(nèi)注入nAChR活性中心的合成多肽（26肽鏈）后，使小鼠體內(nèi)大量結(jié)合T淋巴細胞（具有nAChR表型），促進CD4細胞的分化、增殖，使外周血內(nèi)CD4+計數(shù)增加，CD4+會產(chǎn)生細胞因子，刺激nAChR抗體在B細胞中產(chǎn)生。而胸腺生成素會在重癥肌無力小鼠體內(nèi)產(chǎn)生調(diào)節(jié)T細胞分化的作用，使CD4+計數(shù)減少。即得到CD4+（%）結(jié)果：正常對照組<治療組<模型對照組（P<0.05）。而CD8+（%）結(jié)果：治療組<正常對照組<模型對照組，但三組比較無顯著性差異（P>0.05），提示胸腺生成素會在重癥肌無力小鼠體內(nèi)產(chǎn)生使CD8+計數(shù)減少。CD4+/CD8+比值結(jié)果為重癥肌無力治療中的觀察指標(biāo)，CD4+/CD8+比值結(jié)果：正常對照組<治療組<模型對照組，與模型對照組比較，正常對照組和治療組比值接近。提示胸腺生成素在重癥肌無力小鼠體內(nèi)生產(chǎn)雙向免疫調(diào)節(jié)作用，使CD4+、CD8+計數(shù)降低[10]。

綜上所述，胸腺五肽對重癥肌無力的藥效顯著，可進行免疫調(diào)節(jié)。

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