亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        鈣蛋白酶抑制劑對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

        2015-06-10 05:54:26匡重伸許航黃征朱桂云王勝
        關(guān)鍵詞:腦片腦缺血海馬

        匡重伸 許航 黃征 朱桂云 王勝

        鈣蛋白酶(calpain)廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)中,對(duì)調(diào)控人體正常的生理功能起著重要的作用[1]。屬于半胱氨酸蛋白酶超家族中番木瓜蛋白酶家族成員。正常情況下,calpain以無活性的酶原形式存在于休止期細(xì)胞中,腦缺血后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載而激活,激活后的calpain可通過多種途徑導(dǎo)致缺血性腦損傷。隨著對(duì)缺血性腦損傷分子機(jī)制的深入了解,發(fā)現(xiàn)calpain在缺血性腦損傷中起著重要作用[2]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及側(cè)腦室注射技術(shù),研究calpain抑制劑calpeptin對(duì)缺血再灌注后不同時(shí)相大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、缺血側(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡及腦梗死體積,探討calpain抑制劑在腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠144只,體重250~280 g,由石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為四組,每組36只:缺血/再灌注對(duì)照組(MACO組),calpeptin治療組(calpeptin組),溶劑二甲基亞砜對(duì)照組(DMSO組),假手術(shù)組(sham組)。每組又分為再灌注后12、24和48 h三小組,每組12只,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取6只大鼠行TTC染色檢測(cè)腦梗死體積,6只檢測(cè)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。Calpeptin及DMSO購(gòu)至calbiochem公司,TUNEL試劑盒購(gòu)至博士德公司。

        1.2 方法

        1.2.1 給藥方法 手術(shù)前大鼠用1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,俯臥固定于腦立體定位儀上,暴露前囟,調(diào)節(jié)微調(diào)旋鈕,使微量注射器針尖正對(duì)左側(cè)側(cè)腦室(前囟左側(cè)1.8 mm,后0.8 mm),鉆孔,將微量注射器下移至軟腦膜,緩慢進(jìn)針4.5 mm,注射calpeptin 50 μg(溶于DMSO 5 μL中)或DMSO 5 μL,注射時(shí)間5 min,留針5 min,注射后即進(jìn)行造模手術(shù)。

        1.2.2 MCAO模型的建立 參照Belayev等[3]改良的Longa方法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型,假手術(shù)組尼龍線插入的深度為10 mm,其余步驟相同。手術(shù)期間用100 W的白熾燈照射,保持大鼠肛溫在36.5~37.5 ℃。2 h后小心拉出尼龍線10 mm即造成再灌注模型,再次扎緊CCA及其內(nèi)的尼龍線。

        1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 大鼠麻醉清醒后,參考Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定,0分:無神經(jīng)損傷體征;1分:不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪;2分:向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向?qū)?cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走,意識(shí)喪失[4]。分值越高說明大鼠行為障礙越嚴(yán)重。

        1.2.4 TTC染色測(cè)量腦梗死體積 神經(jīng)功能行為評(píng)價(jià)完成后,動(dòng)物麻醉后斷頭處死,迅速取腦,生理鹽水沖洗殘血,置0 ℃生理鹽水中15 min,再取出置于大鼠腦墊中,去掉鼠腦嗅球、小腦和部分低位腦干,剩余部分由前向后行2 mm厚冠狀切片,迅速放入2%TTC溶液中,37 ℃恒溫孵育30 min,染色后置10%甲醛中固定。24 h后取出用數(shù)碼相機(jī)拍照腦片兩面,輸入計(jì)算機(jī),用多功能真彩色病理圖像分析儀及計(jì)算機(jī)病理圖像分析儀測(cè)量腦片兩個(gè)面的梗死面積(玫瑰紅色區(qū)為正常腦組織,蒼白色區(qū)為梗死區(qū)),根據(jù)梯形法計(jì)算出梗死灶體積,各腦片梗死體積之為總的梗死體積。同時(shí)計(jì)算出每個(gè)腦片的體積,每個(gè)腦片的體積之和為整個(gè)腦體積,梗死體積和腦體積之比為梗死體積百分比。

        1.2.5 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL法) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分后經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,依次用4 ℃生理鹽水200 mL及4 ℃ 4%多聚甲醛400 mL經(jīng)左心室升主動(dòng)脈灌注,灌注完立即斷頭取腦,置于4%多聚甲醛中后固定10 h,酒精梯度脫水,石蠟包埋,在海馬與齒狀回互抱處取材,每隔100 μm連續(xù)6 μm切片6張,切片貼附于預(yù)處理的載玻片上,用前脫蠟至水。用TUNEL技術(shù)檢測(cè)大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡,具體操作方法按說明書進(jìn)行。在高倍鏡(×400)下觀察海馬CA1區(qū)中相互不重疊的4個(gè)視野,細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞,計(jì)數(shù)其中陽性細(xì)胞數(shù),取均值。每一批實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽性對(duì)照為在TUNEL標(biāo)記反應(yīng)前用DNaseⅠ(1 mg/mL)37 ℃溫箱孵育切片20 min,結(jié)果細(xì)胞核呈陽性。陰性對(duì)照為TUNEL標(biāo)記反應(yīng)液中省去TUNEL反應(yīng)混合液,而只加標(biāo)記液,結(jié)果細(xì)胞不顯色。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以(x-±s)表示,數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 sham組大鼠蘇醒后未見明顯的神經(jīng)功能學(xué)缺失,MCAO組麻醉蘇醒后即有明顯的神經(jīng)功能缺失,再灌注24 h神經(jīng)功能缺失最為嚴(yán)重。DMSO組與MCAO對(duì)照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各時(shí)間點(diǎn)的calpeptin處理組與同時(shí)間點(diǎn)MCAO組及DMSO組相比神經(jīng)功能有明顯改善,但仍高于sham組。見表1。

        表1 各組大鼠不同再灌注時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分比較(x-±s) 分

        2.2 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡 TUNEL技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),sham組有少量的神經(jīng)元凋亡,MCAO組在缺血2 h再灌注12 h即可檢測(cè)到明顯的神經(jīng)元凋亡,在24 h達(dá)高峰,DMSO組與同時(shí)間點(diǎn)的MCAO組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各時(shí)間點(diǎn)calpeptin組與同時(shí)間點(diǎn)MCAO組及DMSO組比較,凋亡的神經(jīng)元顯著減少。見表2。

        表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)海馬CAN1區(qū)神經(jīng)元凋亡比較(x-±s)

        2.3 腦梗死體積 sham組未見明顯的梗死灶,MCAO組可見比較恒定的白色梗死區(qū),梗死部位主要集中在額頂區(qū)皮質(zhì)、尾殼核背外側(cè)。DMSO組與同時(shí)間點(diǎn)的MCAO組相比梗死體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,各再灌注時(shí)間點(diǎn)calpeptin處理組與同時(shí)間點(diǎn)MCAO組及DMSO組相比,梗死體積顯著減小。見表3。

        表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積比較(x-±s)

        3 討論

        缺血性腦血管病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一,其病理生理過程涉及多種毒性級(jí)聯(lián)過程[5]。calpain在缺血性腦損傷中起著重要的作用而備受關(guān)注,是近年來研究的熱點(diǎn)之一[6]。calpain分為calpainⅠ(又稱μ-calpain)和calpainⅡ(又稱m-calpain)兩種類型,可分別被微摩爾和毫摩爾水平的Ca2+激活[7],在生理狀態(tài)下,calpain以酶原的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[8],在病理情況下(如腦缺血等),細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載,Ca2+與calpain催化區(qū)的特異性鈣調(diào)蛋白樣位點(diǎn)結(jié)合引起構(gòu)象改變,從而使其激活,激活后的calpain可水解關(guān)鍵的細(xì)胞骨架蛋白而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。有研究發(fā)現(xiàn)猴子短暫性全腦缺血后,海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)μ-calpain大量激活,激活后的μ-calpain可水解溶酶體膜連接蛋白,導(dǎo)致溶酶體破裂,導(dǎo)致水解酶大量釋放,造成神經(jīng)元壞死[10]。激活后的calpain還可引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

        以往一直認(rèn)為calpain主要參與細(xì)胞壞死,但越來越多的證據(jù)表明它也在凋亡中也起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制劑PD1506可顯著抑制培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及海馬神經(jīng)元的凋亡,說明calpain參與了神經(jīng)元的凋亡的發(fā)生[11]。

        本研究通過檢測(cè)腦梗死體積、神經(jīng)元的凋亡、神經(jīng)功能評(píng)分3項(xiàng)指標(biāo),顯示側(cè)腦室注射calpeptin可顯著減少M(fèi)CAO術(shù)后大鼠腦梗死體積及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡,并可改善大鼠的神經(jīng)功能。進(jìn)一步證實(shí)calpain抑制劑對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有顯著的腦保護(hù)作用,并且calpeptin抑制腦缺血后神經(jīng)元凋亡可能是其腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。calpain參與腦缺血后神經(jīng)元凋亡的機(jī)制目前尚不很清楚,目前認(rèn)為其可能的機(jī)制有:(1)促進(jìn)caspase-3激活從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12];(2)可激活促凋亡蛋白bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13];(3)引起bax/bcl-2的比率增高[14];(4)calpain還可能參與細(xì)胞凋亡過程中的DNA的階梯性裂解及染色體的聚集[15]。本實(shí)驗(yàn)中calpeptin是通過何種途徑抑制缺血后海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡尚不清楚,有待于進(jìn)一步的研究。腦缺血損傷機(jī)制復(fù)雜,在過去的十年,國(guó)內(nèi)外學(xué)者在關(guān)于calpain在腦缺損傷中的作用機(jī)制方面進(jìn)行了大量的研究,有學(xué)者認(rèn)為,calpain將成為治療腦損傷的一個(gè)重要靶點(diǎn),研究開發(fā)新型的、副作用小、特異性強(qiáng)的calpain抑制劑,并用于人類臨床治療中,將為腦缺血治療帶來新的希望。

        [1] Sheldon R A, Sadjadi R, Lam M, et al. Alteration in downstream hypoxia gene signaling in neonatal glutathione peroxidase overexpressing mouse brain after hypoxia-ischemia[J]. Developmental Neuroscience,2015,37(4-5):398-406.

        [2] Li H, Zhang N, Sun G, et al. Inhibition of the group Ⅰ mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia[J]. ASN Neuro,2013,5(3):195-207.

        [3] Belayev L, Alonso O F, Busto R, et al. Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture: neurological and pathological evaluation of an improved model[J]. Stroke,1996,27(9):1616-1623.

        [4] Bederson J B, Pitts L H, Tsuj M, et al. Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic evaluation[J]. Stroke,1986,17(3):472-476.

        [5] Suzuki S, Murotomi K, Nakajima Y, et al. Development of an artificial calcium-dependent transcription factor to detect sustained intracellular calcium elevation[J]. ACS Synthetic biology,2014,3(10):717-722.

        [6] Ding Z J, Chen X, Tang X X, et al. Calpain inhibitor PD150606 attenuates glutamate induced spiral ganglion neuron apoptosis through apoptosis inducing factor pathway in vitro[J]. PloS One,2015,10(4):e0 123 130.

        [7] Sonobe T, Akiyama T, Du C K, et al. Contribution of calpain to myoglobin efflux from cardiomyocytes during ischaemia and after reperfusion in anaesthetized rats[J]. Acta Physiologica,2014,210(4):823-831.

        [8] Song Y J, Li D, Pan L P, et al. The suppression of epileptiform discharges in cultured hippocampal neurons is regulated via alterations in full-length tropomyosin-related kinase type B receptors signalling activity[J]. The European Journal of Neuroscience,2014,40(3):2564-2575.

        [9] Clinkinbeard T, Ghoshal S, Craddock S, et al. Calpain cleaves methionine aminopeptidase-2 in a rat model of ischemia/reperfusion[J].Brain Research,2013,1499(11):129-135.

        [10] Yamashima T, Tonchev A B, Tsukada T, et al. Sustained calpain activation associated with lysosomal rupture executes necrosis of the postischemic CA1 neurons in primates[J]. Hippocampus,2003,13(7):791-800.

        [11] Aggeli I K, Zacharias T. Calcium paradox induces apoptosis in the isolated perfused Rana ridibunda heart: involvement of p38-MAPK and calpain[J]. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology,2013,91(12):1095-1106.

        [12] Sheng P, Kuang Z S, Yan Z, et al. The protective effects and potential mechanism of Calpain inhibitor Calpeptin against focalcerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Mol Biol Rep,2011,38(2):905-912.

        [13] Song Y J, Li D, Pan L P, et al. The suppression of epileptiform discharges in cultured hippocampal neurons is regulated via alterations in full-length tropomyosin-related kinase type B receptors signalling activity[J]. The European Journal of Neuroscience,2014,40(3):2564-2575.

        [14] Kim C, Yun N, Lee Y M, et al. Gel-based protease proteomics for identifying the novel calpain substrates in dopaminergic neuronal cell[J]. J Biol Chem,2013,288(51):36 717-36 732.

        [15] Samantaray S, Patel K S, Knaryan V H, et al. Calpain inhibition prevents ethanol-induced alterations in spinal motoneurons[J].Neurochem Res,2013,38(8):1734-1741.

        猜你喜歡
        腦片腦缺血海馬
        海馬
        海馬
        一大波燒腦片來襲
        “海馬”自述
        不同時(shí)間點(diǎn)的氧糖剝奪對(duì)器官型海馬腦片的影響
        二甲雙胍對(duì)過氧化氫所致腦片損傷的作用研究*
        原花青素對(duì)腦缺血再灌注損傷后腸道功能的保護(hù)作用
        血必凈對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制
        細(xì)胞外組蛋白與腦缺血再灌注損傷關(guān)系的初探
        海馬
        色噜噜狠狠色综合成人网| 国产av在线观看一区二区三区 | 久久中文字幕无码专区| 综合无码一区二区三区四区五区| 成在线人免费视频播放| 五月婷婷六月丁香久久综合| 摸进她的内裤里疯狂揉她动图视频 | 2022国内精品免费福利视频| 五十路一区二区中文字幕| 在线麻豆精东9制片厂av影现网| 乌克兰粉嫩xxx极品hd| 国产福利片无码区在线观看 | 久久久久久99精品| 国产少妇露脸精品自拍网站| 国产精品情侣呻吟对白视频| 老熟女高潮一区二区三区| 久久精品成人91一区二区| 色婷婷精品大在线视频| 国产精品久久久久久久久绿色| 麻豆国产人妻欲求不满谁演的| 激情 一区二区| 国产成人精品久久二区二区91 | 日韩一区三区av在线| 日本少妇浓毛bbwbbwbbw| 国产午夜激无码av毛片| 人妻丝袜中文字幕久久| 久久精品国产亚洲av四叶草| 成人国内精品久久久久一区| 亚洲电影一区二区三区| 亚洲一区二区三区免费av| 高潮毛片无遮挡高清视频播放| 狠狠色噜噜狠狠狠狠888奇禾| 国产精品香蕉网页在线播放| 东北熟妇露脸25分钟| 久久久久波多野结衣高潮| 国产农村三片免费网站| 国产午夜三级精品久久久| 强开少妇嫩苞又嫩又紧九色 | 亚洲综合色区另类av| 9久久精品视香蕉蕉| 快射视频网站在线观看|