任林英， 張祝蘭， 王徳森， 楊煌建， 唐文力， 孫 菲

福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州350007

微波誘變結(jié)合抗性突變篩選放線菌素D高產(chǎn)菌株

任林英， 張祝蘭?， 王徳森， 楊煌建， 唐文力， 孫 菲

福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點實驗室，福州350007

采用微波結(jié)合鏈霉素抗性篩選法選育放線菌素 D的高產(chǎn)菌株。通過考察鏈霉素對 Streptomyces rubiginosohelvolus FIM-N31菌株孢子生長情況的影響確定鏈霉素致死濃度，出發(fā)菌株FIM-N31的孢子經(jīng)微波輻照處理后，涂布在含鏈霉素致死濃度(50μg/mL)的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，獲得了大量的鏈霉素抗性基因突變株。搖瓶發(fā)酵篩選突變株，結(jié)果獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定的放線菌素D高產(chǎn)菌Str186，其產(chǎn)放線菌素D的能力比出發(fā)菌株提高了8倍以上。

:鏈霉菌；放線菌素D；抗生素抗性篩選；復(fù)合誘變

放線菌素D是一種色素肽內(nèi)酯抗生素，是經(jīng)典的抗腫瘤藥物之一[1～3]，與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，并配合放射治療能夠取得良好的效果[4～6]，其抗癌作用可能與其色基結(jié)構(gòu)有較為密切的關(guān)系，而其環(huán)肽部分可能起到一種載體的作用[7]。其獨特的環(huán)肽化學結(jié)構(gòu)、抑制RNA合成的抗腫瘤機理，以及不易與其他化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性的特點是化療藥物難得的優(yōu)點，因此，近年來對其研究一直非?；钴S，不斷發(fā)現(xiàn)新的靶點和抗腫瘤作用的新機制。但天然放線菌素D有較大的毒性，限制了其在臨床上的應(yīng)用范圍，因此對放線菌素D進行結(jié)構(gòu)改造以降低其毒性作用、對不同來源的產(chǎn)生菌進行研究以獲得高效生產(chǎn)菌種及篩選低毒高效抗腫瘤活性的類似物等成為藥物開發(fā)者的新關(guān)注點。前期在定向篩選抗腫瘤活性先導(dǎo)物的過程中，分離獲得產(chǎn)放線菌素D的菌株FIM-N31，鑒定其為銹赤蠟黃鏈霉菌(Streptomyces rubiginosohelvolus)。本研究在初步探索菌株FIMN31生物合成放線菌素D培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，運用微波誘變與抗藥性基因突變組合技術(shù)對該野生菌株FIM-N31進行理性篩選，旨在獲得放線菌素D高產(chǎn)菌株，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種。

1 材料與方法

1.1 菌種

鏈霉菌 Streptomyces rubiginosohelvolus FIMN31由福建省微生物研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基(%，w/V):可溶性淀粉1.0，葡萄糖1.0，硫酸鎂0.05，硝酸鉀0.1，磷酸氫二鉀0.05，瓊脂2.0，pH 7.0～7.2；種子培養(yǎng)基(%，w/V):可溶性淀粉2.5，葡萄糖0.5，黃豆粉1.0，蛋白胨0.5，酵母膏0.3，pH 7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基(%，w/V):可溶性淀粉2.5，黃豆粉3.5，蛋白胨0.5，玉米粉1.0，磷酸氫二鉀0.05，pH 7.0～7.2。

1.3 方法

1.3.1 原始菌懸液的制備 取4℃保存的原始菌FIM-N31試管斜面生長物適量，劃線接種在斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)8 d后，刮取生長良好的菌苔，置于裝有適量無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中振蕩，制備均勻的菌懸液。

1.3.2 鏈霉素最低抑菌濃度的測定 分別取上述菌懸液100μL均勻涂布在不同濃度(5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL)鏈霉素的分離平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)并觀察菌落的生長情況。將沒有菌落形成的鏈霉素最低濃度即抗生素對出發(fā)菌株的孢子致死濃度確定為鏈霉素的最低抑菌濃度(MIC)。

1.3.3 原始菌懸液的微波誘變 在無菌條件下，取原始菌懸液6 mL裝入預(yù)先滅菌的15 mL試管中并加防菌硅膠透氣塞，以冰浴法消除微波的熱效應(yīng)，將試管插入盛有適量冰水(作為冷卻劑)的三角瓶里，使菌懸液的上液面沒入冰水中，將三角瓶移置微波爐中，對菌懸液進行不同時間(15 s、30 s、45 s、60 s、90 s和120 s)的微波輻照處理。

1.3.4 鏈霉素抗性篩選 取經(jīng)微波誘變處理后的菌懸液適當稀釋后各100μL，分別均勻涂布在含有MIC濃度鏈霉素的分離培養(yǎng)基平板上，于30℃培養(yǎng)8 d，在平板上生長出的菌落均為鏈霉素抗性基因(sir)突變株。挑取單菌落劃線接種于平板斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并保存于4℃冰箱中。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)與樣品處理 將突變株分別接種于裝有50mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃、250 r/min搖床發(fā)酵5 d，取發(fā)酵液適量，加入2倍于發(fā)酵液體積的無水乙醇，充分振蕩、靜置、離心，取上清液過濾后進行HPLC檢測。

1.3.6 含量(效價)測定 采用HPLC法，分離條件:Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5μm)色譜柱，波長254 nm，以甲醇∶水＝78∶22(V/V)為流動相，流速 1.0 mL/min，柱溫:35℃。以放線菌素 D (Sigma公司)為對照品，根據(jù)公式(1)計算效價，發(fā)酵效價為3次平均值，以相對值標示。

1.4 主要設(shè)備

WD800型微波爐(Galanz公司)；1360B型超凈工作臺(北京亞泰科隆公司)；MIR-253型微生物培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；ZHWY-2102大型恒溫搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；Allegra X-15R型離心機(德國BECKMAN公司)；LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)。

2 結(jié)果與分析

2.1 M IC值測定

經(jīng)多次平行實驗，鏈霉素對鏈霉菌FIM-N31菌株孢子的致死濃度測定結(jié)果見表1，表明鏈霉素對鏈霉菌 FIM-N31菌株孢子的 MIC值為50μg/mL，以此為致死抗藥性突變標志。

表1 鏈霉素對FIM-N31菌株孢子致死濃度測定Table 1 Lethal concentration determination of streptomycin on FIM-N31 spore.

2.2 微波誘變效應(yīng)

取微波輻照前后FIM-N31的菌懸液適當稀釋后各100μL，分別均勻涂布在平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)8 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IM-N31在處理前生長良好，菌落生長數(shù)量隨著微波輻照時間的增長呈減少趨勢，經(jīng)微波輻照90 s以上生長受到明顯抑制，平板上只有少數(shù)的菌落生長，易于單菌落挑選，如圖1(彩圖見圖版二)所示。

2.3 鏈霉素抗性基因突變株篩選

在15～120 s范圍內(nèi)的不同時間微波輻照后進行鏈霉素抗性基因突變株的篩選試驗，其微波輻照時間與篩選獲取抗性突變株數(shù)目之間的關(guān)系曲線如圖2所示，結(jié)果表明獲取的抗性突變株數(shù)目隨微波輻照時間的增多而呈現(xiàn)先增后減的分布趨勢，誘變效應(yīng)存在一個最佳區(qū)域，微波輻照時間為60 s時誘變效果最佳，獲得突變株數(shù)達高峰，因此初步認為篩選獲得FIM-N31鏈霉素抗性基因突變株的最佳微波輻照誘變時間應(yīng)為60 s。

圖1 FIM-N31菌株微波處理前后生長菌落比較Fig.1 Growth comparison of FIM-N31 strain before and aftermicrowave treatment.

圖2 微波輻照時間與篩選獲得突變株之間的關(guān)系曲線Fig.2 Relation curve between microwave irradiation and mutants obtained.

經(jīng)微波誘變結(jié)合鏈霉素抗性篩選，獲得鏈霉素抗性基因突變株共計213株。對所得菌株進行搖瓶發(fā)酵初篩，通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)及發(fā)酵樣品的處理，采用HPLC檢測其放線菌素D含量。以誘變出發(fā)菌株的發(fā)酵效價為100，計算突變株的發(fā)酵相對效價，初篩結(jié)果71株為正突變菌株(相對效價在110以上)，50株為未突變菌株(相對效價在90～110)，92株為負突變菌株(相對效價在90以下)，如表2所示。

取初篩入選菌株進行二級搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，在反復(fù)的篩選中，5株微波誘變突變株發(fā)酵水平較出發(fā)株FIM-N31提高50%以上，顯示出較好的產(chǎn)放線菌素D能力，分別為Str059、Str152、Str178、 Str186和Str195，其中突變株Str186產(chǎn)放線菌素D較出發(fā)株FIM-N31提高8倍(表3)。圖3為突變株Str186發(fā)酵液與FIM-N31發(fā)酵液的HPLC圖譜，表明突變株Str186發(fā)酵液的目標產(chǎn)物放線菌素D含量大幅度提高，而小組分放線菌素S含量僅為出發(fā)菌株的2倍多，初步提示所獲得的突變株Str186更利于制備高純度放線菌素D，即更利于放線菌素D分離純化的開展。

表2 抗鏈霉素突變株初篩結(jié)果Table 2 The preliminary results of streptomycin-resistant mutants.

表3 抗性突變高產(chǎn)菌株的搖瓶發(fā)酵情況Table 3 Fermentation of the high-producing streptomycin-resistant mutants.

2.4 Str 186菌株穩(wěn)定性考察

將菌株Str186接種于斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于4℃保藏，考察保藏不同時間的菌株Str186發(fā)酵水平，結(jié)果(表4)表明菌種斜面在4℃保藏3個月效價穩(wěn)定；同時對菌株Str186連續(xù)傳代培養(yǎng)考察菌種的傳代穩(wěn)定性，檢測其生物合成能力，以4℃保存7 d生長良好的第一代菌株為對照，結(jié)果見表5，表明菌株Str186傳5代對發(fā)酵水平無明顯影響，提示菌株Str 186遺傳穩(wěn)定性較好。

圖3 HPLC圖譜比較Fig.3 Comparison of HPLC spectra.

表4 Str186菌株保藏時間穩(wěn)定性試驗Table 4 The stability test of preservation times for Str186.

表5 Str186菌株傳代穩(wěn)定性試驗Table 5 The test of passage stability for Str186.

3 討論

放線菌素D的研究目前主要集中于放線菌素D的生物學功能和臨床藥理學，并己廣泛用于惡性腫瘤的臨床治療，但對微生物發(fā)酵和分離純化方面的研究報道較少，目前國內(nèi)放線菌素D生產(chǎn)中存在菌種發(fā)酵水平低、產(chǎn)率低、單耗高的缺陷，菌種選育已成為提高放線菌素D產(chǎn)量和質(zhì)量的重要課題。廖愛芳等[8]采用紫外線誘變結(jié)合纈氨酸耐性變種的篩選，得到產(chǎn)量提高2倍的放線菌素D突變株，本研究應(yīng)用分子育種中關(guān)于抗生素產(chǎn)生菌抗性基因與抗生素合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因連鎖而易發(fā)生共突變理論，首次將微波誘變結(jié)合抗生素抗性篩選方法應(yīng)用于放線菌素D的選育，獲得良好的效果。在微波誘變試驗中采用低溫熱分散法消除微波的熱效應(yīng)，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，微波輻照45 s后作為冷卻劑的冰水仍有部分冰未完全融解，受試菌懸液的溫度也并未升高。因此，在微波輻照實際操作中，每輻照45 s即更換冰水，盡可能消除微波熱效應(yīng)對受試菌的影響，同時凸顯出非熱效應(yīng)對受試菌的誘變作用。鏈霉素抗性篩選具有廣譜性、正突變率和增產(chǎn)百分率高等特點，以鏈霉素抗性作為選擇壓力，對許多抗生素產(chǎn)生菌進行推理選育所得到的突變株中都能獲得較高頻率的高效價突變株[9～13]。

本試驗中通過組合運用微波誘變與鏈霉素抗性突變篩選技術(shù)，改造了Streptomyces rubiginosohelvolus FIM-N31菌株的代謝功能，篩選所獲取的抗性突變株數(shù)目較多，隨之篩選較好的活性突變株的幾率亦提高，有利于高效獲得遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良高活性突變株，其中突變菌株Str186遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)放線菌素D能力強，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

影響菌種的菌體生長和產(chǎn)素能力的因素很多，如發(fā)酵培養(yǎng)基成分與初始pH、生長因子與前體物、溶氧、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等影響因子，某種代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)或抑制、菌體生長形態(tài)與目標產(chǎn)物合成之間的關(guān)系，優(yōu)良菌種在最適宜發(fā)酵條件下才能充分發(fā)揮菌株的遺傳潛力，因此突變菌株Str186生物合成放線菌素D的調(diào)控過程的優(yōu)化也有待深入探究。

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Screening of Actinomycin D High-producing Strain by Streptomycin Resistant Mutant Selection Coupled with Microwave Mutagenesis

REN Lin-ying，ZHANG Zhu-lan?，WANG De-sen，YANG Huang-jian，TANGWen-li，SUN Fei
Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，F(xiàn)ujian Institute of Microbiology，F(xiàn)uzhou 350007，China

Microwave mutagenesis and streptomycin resistance screening was applied to screen actinomycin D high-producting strain.After testing the resistance of Streptomyce rubiginosohelvolus FIM-N31 to streptomycin，the lethal concentration of streptomycin was determined.A lot of streptomycin-resistant mutants were screened after the spores regenerated on the lethal streptomycin concentration(50μg/mL)media when they were treated with microwave irradiation.Itwas eventually found that the high-yield strain Str186 from these mutants which was stably inheritable，and the productivity was beyond eight times higher than the original strains in the rotation-flask experiments.

Streptomyces；actinomycin D；antibiotics resistance gene screening；compound mutation

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.09

2015-05-08；接受日期:2015-06-15

福建省科技項目(2014R1009-10)資助。

任林英，高級工程師，研究方向為微生物藥物。E-mail:rlymary＠aliyun.com。?通信作者:張祝蘭，研究員，研究方向為微生物藥物。E-mail:jessylan9963＠sina.com