龐偉民， 靳 茜， 王旭靜， 楊江濤， 呂少溥， 唐巧玲， 王志興

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

陸地棉纖維優(yōu)勢表達基因GhRACK1的克隆與序列分析

龐偉民， 靳 茜， 王旭靜， 楊江濤， 呂少溥， 唐巧玲， 王志興?

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

纖維品質(zhì)改良是我國棉花育種的主要目標(biāo)之一，纖維特異或優(yōu)勢表達基因的挖掘是利用基因工程手段改良纖維品質(zhì)的關(guān)鍵。根據(jù)蘇棉12纖維中優(yōu)勢表達的GhRACK1 EST序列設(shè)計引物，通過RACE技術(shù)克隆了GhRACK1基因的全長cDNA。推導(dǎo)的氨基酸序列含有4個串聯(lián)的WD基序，屬于WD40重復(fù)家族，與已知的RACK1蛋白同源性達70%以上，PDB模擬的蛋白三維結(jié)構(gòu)也與已知的RACK1蛋白結(jié)構(gòu)相似。熒光定量PCR分析表明GhRACK1在纖維中的表達量比葉片中高20倍以上。研究結(jié)果為棉花纖維品質(zhì)改良基因工程提供了新的基因資源。

陸地棉；纖維優(yōu)勢表達；GhRACK1；克隆與分析

隨著時代的進步和科技的發(fā)展，人們對纖維品質(zhì)的要求越來越高，我國傳統(tǒng)育種的棉花纖維已不能滿足高檔紡織品的需求，根據(jù)2001-2005年農(nóng)業(yè)部對我國棉花主產(chǎn)省主栽品種棉纖維的抽查結(jié)果表明，目前我國棉花纖維質(zhì)量能夠滿足紡織工業(yè)紡中、低檔棉紗(32～40支紗)的要求，但可紡高支紗(60～80支)的原棉纖維所占比例較少[1]。這就急需對棉花纖維品質(zhì)進行改良，纖維品質(zhì)改良成為我國棉花育種的主要目標(biāo)之一。

由于受育種周期長、外源種質(zhì)利用困難、纖維品質(zhì)與產(chǎn)量性狀間呈負(fù)相關(guān)等因素的限制，用常規(guī)育種的方法較難培育出纖維品質(zhì)優(yōu)良的棉花新品種。分子生物學(xué)的發(fā)展為利用基因工程技術(shù)改良棉花的纖維品質(zhì)提供了新的思路。自1992年John[2]首次克隆了棉纖維特異表達基因E6以來，研究者們通過cDNA文庫差示篩選技術(shù)、抑制差減雜交技術(shù)、mRNA差異顯示技術(shù)等先后從棉花中克隆了數(shù)十個棉纖維優(yōu)勢或特異表達的基因[3～5]，這為棉花纖維品質(zhì)改良基因工程提供了豐富的基因資源。但目前仍缺乏有商業(yè)化應(yīng)用前景的纖維發(fā)育相關(guān)基因。

蛋白激酶 C受體(receptor for activated C kinase 1，RACK1)普遍存在于動植物中，是一種高度保守的WD40重復(fù)蛋白。RACK1蛋白最早從煙草愈傷組織中被發(fā)現(xiàn)，目前已從擬南芥、水稻、煙草、苜蓿和藻類等多種植物中克隆到了RACK1基因[6～10]。RACK1蛋白在細(xì)胞骨架、蛋白運輸、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分生組織形成等生命活動中都扮演重要角色[11]。

本實驗室利用差減技術(shù)克隆到了纖維伸長期中優(yōu)勢表達的RACK1基因的EST序列，本研究利用RACE技術(shù)克隆此EST序列的3′端和5′端序列，獲得基因的全長cDNA序列，并對得到的序列進行分析，獲得了新的棉纖維優(yōu)勢表達基因GhRACK1，以期為棉花纖維品質(zhì)改良基因工程提供新的基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

取陸地棉蘇棉12花后14 d(纖維伸長期)的棉鈴，用滅過菌的鑷子剝?nèi)±w維，液氮速凍后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司；感受態(tài)菌株Trans10購自全式金公司；瓊脂糖膠回收試劑盒購自 BioMed公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司和TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；其他常規(guī)試劑為分析純。

引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。本研究所用引物見表1。序列測定由上海擎科生物股份有限公司和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大科學(xué)工程開放實驗室測序部完成。

1.2 方法

1.2.1 全長GhRACK1 cDNA的克隆 參考3′-Full RACE Core Set(TaKaRa公司)試劑盒說明書，以3′RACE cygOuter Primer/p-F2和3′RACE cygInner Primer/p-F3為引物(表 1)，通過2次PCR從棉纖維cDNA中擴增得到GhRACK1 3′末端產(chǎn)物，PCR反應(yīng)條件為:94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 8 min。同理，根據(jù)TaKaRa公司的5′-Full RACE Kit試劑盒說明書，首先對纖維RNA進行脫磷、脫帽，然后以O(shè)ligo dT為引物進行反轉(zhuǎn)錄，最后分別以5′RACE cygOuter Primer引物和p-R2，5′RACE cyg Inner Primer引物和p-R3進行兩次PCR得到5′末端產(chǎn)物，PCR反應(yīng)條件為:94℃ 4 min；94℃ 45 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 8 min。RACE 得到的產(chǎn)物連接到 pMD18T-Vector (TaKaRa公司)上，篩選鑒定陽性克隆，并進行序列測定。用DNAMAN軟件分析組裝5′和3′序列獲得GbXET全長cDNA。

表1 本研究所用引物Table 1 The primer sequences used in this study.

1.2.2 GhRACK1 cDNA基因的表達模式分析 利用熱RNAprep Pure Plant Kit(天根生化科技有限公司)提取陸地棉蘇棉12葉片和花后14 d纖維組織的 RNA，然后根據(jù) RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司)說明進行反轉(zhuǎn)錄獲得葉片和纖維cDNA。同時根據(jù)已知的基因序列設(shè)計引物pF1和pR1。然后以pF1和pR1為引物，纖維和葉片cDNA為模板進行熒光定量PCR分析，具體操作按照7500熒光定量PCR操作手冊進行。

1.2.3 GhRACK1序列分析 采用DNAMAN軟件進行基因序列的拼接和同源進化樹分析。利用NCBI/BLAST/BLASTp分析 GhRACK1與已知RACK1蛋白的同源性。利用PDB軟件進行蛋白結(jié)構(gòu)分析。用Phytozome在線軟件分析其在棉花染色體上的定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhRACK1基因全長cDNA的獲得

根據(jù)已知的GhRACK1 EST序列設(shè)計引物，利用3′RACE和PCR擴增得到一條200 bp左右的條帶，5′RACE和PCR擴增得到一條1.2 kb左右的條帶(圖1A、B)，測序結(jié)果表明它們分別是基因的3′和5′末端序列，經(jīng)DNAMAN軟件分析后拼接得到了基因的全長cDNA序列。根據(jù)拼接得到的基因序列設(shè)計引物，以花后 14 d的纖維cDNA為模板進行PCR擴增，得到了GhRACK1的全長 cDNA(圖 1C)。測序證明擴增得到的GhRACK1與拼接得到的序列完全一致。

圖1 GhRACK1基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR results of GhRACK1 gene.

2.2 GhRACK1基因的序列分析

獲得的 GhRACK1全長1 375 bp，其中包括67 bp的5′非翻譯區(qū)，984 bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，324 bp的3′非翻譯區(qū)，ORF編碼一個由327個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，分子量為32 kDa(圖2)。BLASTn比對結(jié)果表明，獲得的GhRACK1基因與已知的RACK1基因同源性較高，與木瓜和擬南芥中的RACK1基因的核苷酸序列同源性分別為77.13%和74.77%。Phytozome在線軟件分析表明GhRACK1基因位于第6號染色體上。

圖2 推導(dǎo)的GhRACK1蛋白的氨基酸序列Fig.2 Deduced amino acid sequence of GhRACK1 protein.

蛋白同源性分析結(jié)果表明，推導(dǎo)的蛋白與WD40重復(fù)蛋白家族中的RACK1蛋白具有很高的相似性，與木瓜中的RACK1蛋白(O24076)同源性最高，親緣關(guān)系最近，相似性可達89%，其次為油菜(Q39336)，相似性為88%；與其他已知的RACK1蛋白的相似性也都在80%以上，如與擬南芥(NP188441.1)和甜椒(AJE63428.1)中的RACK1相似性分別為85%和84%(圖3)。而且推導(dǎo)的氨基酸序列中含有3個GH和5個WD二肽保守序列，形成3個串聯(lián)的WD基序(圖2)。PDB模擬蛋白三維結(jié)構(gòu)顯示，推導(dǎo)的氨基酸序列能形成7片螺旋槳結(jié)構(gòu)，而且每個漿片包含4個反向平行的β折疊(圖4，彩圖見圖版一)。

圖3 推導(dǎo)的GhRACK1氨基酸序列與已知RACK1蛋白的同源進化樹分析Fig.3 Homologous tree analysis of deduced GhRACK1 amino acid sequence and other known RACK1 protein.

圖4 模擬的GhRACK1蛋白與擬南芥RACK1三維結(jié)構(gòu)之間的比較Fig.4 Comparison of dimensional structure of GhRACK1 and Arobidopsis RACK1 protein.

2.3 GhRACK1的組織表達特異性分析

以陸地棉蘇棉12葉片和花后14 d纖維的cDNA為模板進行熒光定量PCR分析，結(jié)果表明GhRACK1在纖維中高表達，在葉片中只有微量表達，纖維中的表達量是葉片中表達量的20倍左右，為纖維優(yōu)勢表達基因(圖5)。

圖5 qPCR分析GhRACK1基因在葉片和纖維中的表達量Fig.5 Expression analysis of GhRACK1 gene between leaf and fiber by qPCR.

3 討論

RACK1蛋白是一種高度保守的WD40重復(fù)蛋白。WD40重復(fù)蛋白一般含有1～10個串聯(lián)的WD40基序。WD40基序以甘氨酸-組氨酸(GH)開始，色氨酸-天冬氨酸(WD)保守二肽結(jié)尾[12]。Ullah等[13]研究表明擬南芥RACK1具有7片螺旋槳片，每個槳片包含4個反向平行的β折疊片。本研究克隆的基因推導(dǎo)的氨基酸序列與已知RACK1蛋白的同源性在80%以上，含有4個串聯(lián)的WD基序，PDB預(yù)測的蛋白三維結(jié)構(gòu)與已知RACK1蛋白的三維結(jié)構(gòu)相似，由此推測克隆的基因為陸地棉中的RACK1基因，命名為GhRACK1。

棉花纖維的發(fā)育與激素調(diào)控、細(xì)胞壁代謝、信號傳導(dǎo)、脂肪酸代謝、糖代謝和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等多個方面相關(guān)[14～18]。研究表明:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶(xyloglucan endotransglycosylases/hydrolases)是一種細(xì)胞壁松弛酶，通過改變細(xì)胞壁網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞壁的松弛，在細(xì)胞伸長過程中起重要作用，過量表達棉花GhXTH基因能使纖維的長度增加15%～20%[19]；一些纖維素合酶基因的表達在纖維發(fā)育的次生壁沉積期明顯上調(diào)[20]。ROS信號傳導(dǎo)途徑能促進纖維的伸長[21]，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)H2O2含量的基因GhAPX和GhPOX在迅速伸長的棉纖維中優(yōu)勢表達[21～23]，蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明ROS的動態(tài)平衡是調(diào)控棉纖維形態(tài)產(chǎn)生的主要機制[24]。乙烯作為纖維伸長信號傳導(dǎo)過程中的順勢作用因子參與纖維發(fā)育[25，26]，細(xì)胞分裂素能夠抑制纖維細(xì)胞的伸長[27]。已有研究表明，植物RACK1不僅是信號傳導(dǎo)中的主要成員，而且在激素響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。如擬南芥RACK1負(fù)調(diào)控ABA的響應(yīng)[28]，Chen等[29]研究表明擬南芥RACK1A發(fā)生缺失突變后，表現(xiàn)出對多種激素反應(yīng)發(fā)生改變。本研究克隆的GhRACK1基因在纖維伸長期優(yōu)勢表達，但GhRACK1如何調(diào)控纖維發(fā)育仍需進一步深入研究。

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Cloning and Sequence Analysis of GhRACK1 Gene Dom inant Expressed in Fiber from Gossypium hirsutum

PANG Wei-min，JIN Xi，WANG Xu-jing，YANG Jiang-tao，LV Shao-pu，TANG Qiao-ling，WANG Zhi-xing?
Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Scienses，Beijing 100081，China

Fiber quality improvement is one of themain targets in cotton breeding.The discovery of specific or dominantexpressed gene in fiber is the key factor that improved fiber quality by using genetic engineering strategy.In this study，we used G.hirsutum var.Sumian12 as a starting material to clone the full-length cDNA of GhRACK1 gene by RACE techniques according known EST sequence.The deduced amino acid sequence of GhRACK1 was highly homologous to the other known RACK1 proteins and contained 4 cascade WD motifs，which belonged to WD40 family.GhRACK1 protein and known RACE1 had similar three dimensional structure by PDB simulation.qPCR results indicated that the expression level of GhRACK1 in fiber was more than 20-fold compared with leaf.This study provided new gene resource for cotton fiber improvement.

Gossypium hirsutum；fiber-superiority expression；GhRACK1；cloning and sequence analysis

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.07

2015-06-03；接受日期:2015-07-13

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08005-003)資助。

龐偉民，碩士研究生，研究方向為轉(zhuǎn)基因生物安全。Tel:010-82109866；E-mail:543513441＠qq.com。?通信作者:王志興，研究員，博士，主要從事植物基因工程與轉(zhuǎn)基因生物安全研究。Tel:010-82106102；E-mail:wangcotton＠126.com