陳 蕊，嚴(yán) 月，趙東旭

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081）

磁性微球固定化膠原酶篩選抑制劑的研究

陳 蕊，嚴(yán) 月，趙東旭

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081）

以表面修飾的磁性微球作為載體，以共價(jià)結(jié)合的方式將膠原酶固定化，從56種中草藥中快速篩選具有抑制作用的種類。結(jié)果表明：表面羧基磁性微球與膠原酶能較好地固定化，酶的反應(yīng)濃度為2mg/m L，并且不影響其活性。以SDS-PAGE電泳的方法作為檢測(cè)手段，從56種中草藥中篩選出草河車對(duì)膠原酶具有較好的抑制作用。

磁性微球；固定化；膠原酶；中草藥；抑制劑

高分子磁性微球作為一種優(yōu)良的酶固定化載體，能夠顯著提高酶的操作穩(wěn)定性和使用壽命，降低生產(chǎn)成本，便于自動(dòng)化操作，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。膠原酶是基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）中的一種，是一種具有高度專一性的蛋白酶，在人體組織正常代謝及減輕病理?yè)p壞中起著重要作用。相關(guān)資料表明，基質(zhì)金屬蛋白酶及其相關(guān)組織物調(diào)控著細(xì)胞外基質(zhì)的更新［1］，維持細(xì)胞的穩(wěn)定性，如腫瘤侵入及擴(kuò)散轉(zhuǎn)移、骨關(guān)節(jié)炎、心血管疾病等［2］，都與MMPs調(diào)控失衡有著密切的關(guān)系。目前，MMPs的抑制劑主要可以分為5類［3］，包括異羥肟酸類、反式異羥肟酸類、非異羥肟酸類、非鋅離子結(jié)合基類以及各種天然產(chǎn)物。而膠原酶的抑制劑主要有3類，包括天然抑制劑、人工合成抑制劑以及抗體類抑制劑。因此，探索和研究膠原酶天然抑制劑是尋找治療相關(guān)疾病所迫切需求的。

基于上述背景，本實(shí)驗(yàn)以表面修飾的磁性微球作為載體，將膠原酶固定化后，從多種中草藥中快速篩選具有抑制作用的種類。在此研究中需要解決的關(guān)鍵問題是磁性微球與膠原酶的固定化以及固定化后膠原酶活性的測(cè)定，然后利用固定化的膠原酶從中草藥提取液中篩選其抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

表面羧基修飾的磁性微球，購(gòu)于天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心；Ⅰ型膠原酶，購(gòu)于北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；Ⅰ型酸溶性膠原蛋白（非純），購(gòu)于成都新際生物活性膠原開發(fā)有限公司；BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)于生工生物工程（上海）有限公司；各種中藥材，均購(gòu)于北京同仁堂藥店。

1.2羧基磁球?qū)γ傅墓潭ɑ?/p>

1.2.1 磁球固定化原理［4］

EDC（1-(3-Dimethylam inopropyl)-3-ethylcarbodiim ide hydrochloride）是可溶于水的碳二亞胺，在酰胺合成中用作羧基的活化試劑，使用時(shí)的pH值范圍為4.0～6.0，常和N-羥基琥珀酰亞胺連用，以提高偶聯(lián)效率。

1.2.2羧基磁球與酶的共價(jià)連接

［5］，具體操作如下：1）將磁球搖勻后取1000μL于2m L離心管中，在磁分離條件下用MES緩沖液（50mM，pH值6.0）洗3遍，棄上清。2）稱取EDC 20mg溶于200μLMES緩沖液中，N-羥基琥珀酰亞胺20mg溶于200μLMES緩沖液中，即濃度均為100mg/ m L，2種溶液依次加入磁球中混勻。3）將反應(yīng)樣品放入30℃搖床中，180 r/min，反應(yīng)30min。4）反應(yīng)后，在磁分離條件下用PBS緩沖液（10mmol/L，pH值7.4）洗3次，棄上清。加入2mg/m L的酶1m L，在同樣條件下反應(yīng)1 h。5）用PBS緩沖液清洗4次，每次600μL，收集洗液待測(cè)濃度。固定化酶于4℃冰箱中保存待用。

1.3載酶量的測(cè)定

通過測(cè)定固定化酶洗液中膠原酶水解Ⅰ型膠原蛋白的能力，可知膠原酶的酶活，進(jìn)而可得出未連接的酶量。根據(jù)BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的相關(guān)操作摸索出最佳的實(shí)驗(yàn)條件，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］。

1.3.1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線酶濃度的設(shè)定與配制（表1）；2）取7支2m L離心管，各管分別加入500μL相應(yīng)濃度的配制好的酶溶液，然后各管分別加入500μL蛋白工作液，迅速混勻；3）在60℃金屬浴中保溫1 h，冷卻至室溫后，以酶濃度為0的管作對(duì)照，在分光光度計(jì)上測(cè)各管的D562nm值。4）以各管的D562nm為縱坐標(biāo)，酶濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 磁球載酶量的測(cè)定

樣品蛋白質(zhì)濃度乘以總體積得到洗下的酶的量，總酶量已知，于是：

磁球載酶量=（總酶量-洗液中酶量）（mg）/磁球的量（g）

1）取3支2m L的離心管，其中一管加入500μL蒸餾水作為對(duì)照，另外兩管分別加入濃度相同的500μL樣品稀釋液。2）各管分別加入500μL蛋白工作液，迅速混勻，在60℃金屬浴中保溫1 h。冷卻至室溫后，在分光光度計(jì)上測(cè)各管D562nm值。3）取兩個(gè)相同樣品稀釋液的D562nm值的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定出該樣品經(jīng)稀釋后的蛋白質(zhì)濃度。4）根據(jù)下式計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)濃度：

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定用酶濃度Table 1 The determ ination of the standard curveof enzyme concentration

樣品蛋白濃度（μg/m L）=該樣品稀釋后的蛋白質(zhì)濃度×樣品稀釋倍數(shù)。

1.4 固定化酶的活性檢測(cè)

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)可知膠原酶活力的測(cè)定方法，如羥脯氨酸法［7］、膠原懸浮分析法［8］、放射性標(biāo)記法［9］、熒光法［10］、考馬斯亮藍(lán)法［11］等。然而以上多種方法中，或需要特殊儀器設(shè)備，或操作過程繁瑣。本實(shí)驗(yàn)最終確定利用SDS-PAGE電泳的方法對(duì)膠原酶活性進(jìn)行測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)便，可信度高。SDS-PAGE方法參考文獻(xiàn)［12］。

1）SDS-PAGE凝膠配制：濃縮膠濃度為5%、分離膠濃度為10%。2）凝膠板的制備：將混勻的分離膠約3.7m L加到玻璃板的縫隙內(nèi)，用1m L蒸餾水水封。約30min后，將上層水倒去，加入約1m L濃縮膠，插入樣品梳。約30m in后，小心拔出梳子。向電泳槽中加入電極緩沖液。3）上樣、電泳。制備好相應(yīng)的電泳樣品，用微量注射器取10μL加到上樣槽中，針頭盡量插入上樣槽內(nèi)部。進(jìn)樣結(jié)束后打開電源，將電壓調(diào)至70 V開始電泳，約15min后，樣品在電場(chǎng)作用下進(jìn)入分離膠。再將電壓調(diào)至150V左右。待染料前沿遷移至距硅膠框底邊1 cm左右，停止電泳。

1.5 中草藥的提取

查閱相關(guān)文獻(xiàn)［13-16］，本研究采用56種可能具有相關(guān)疾病防治的中草藥，根據(jù)其藥用部位，分為塊根塊莖類、全草類、果實(shí)類、葉類、礦物類6大類中藥。中草藥的處理步驟如下：

1）取所需中藥材分別進(jìn)行粉粹，與蒸餾水以1∶10比例混合，靜置2 h，于95℃進(jìn)行煎煮1～2 h。2）煎煮后靜置冷卻至室溫，然后用布氏漏斗過濾、10000 r/min離心30min，收集中草藥上清液。3）取上述中草藥上清液于分液漏斗中，與水飽和的正丁醇以1∶1的比例混合，振蕩后靜置12 h。待兩相分層后，取下層的水相。4）經(jīng)正丁醇萃取后的水相，用70%的乙醇進(jìn)行沉淀，萃取后于10000 r/m in的轉(zhuǎn)速下離心20min，取上清液備用。

2 結(jié)果與分析

2.1所用膠原酶以及膠原蛋白電泳檢測(cè)

圖1 膠原酶與膠原蛋白電泳圖Fig 1 Theelectrophorogram of collagenaseand collagen proteina—Ⅰ型膠原酶；b—Ⅰ型膠原蛋白

圖1表明，Ⅰ型膠原酶分子質(zhì)量為120 ku；膠原蛋白的最大條帶在100～150 ku之間，除此之外還有其他條帶，是因?yàn)榈鞍讟悠凡患兯隆?/p>

2.2羧基磁球固定化酶

圖2中未加交聯(lián)劑EDC的羧基磁球固定化酶是按照羧基磁球固定化酶的操作步驟，以排除磁球?qū)δz原酶本身的吸附作用和驗(yàn)證清洗的步驟是否徹底。從電泳圖中可以看出，膠原蛋白的條帶和未加交聯(lián)劑的羧基磁球固定化酶與蛋白溶液反應(yīng)后的條帶幾乎相同，說明不加交聯(lián)劑膠原酶不會(huì)連接到羧基磁球上，而羧基磁球固定化酶與蛋白溶液反應(yīng)后蛋白條帶明顯變淺，說明膠原酶已經(jīng)被成功地固定到羧基修飾的磁球上并發(fā)揮良好的活性水解作用。

2.3羧基磁球固定化酶反應(yīng)時(shí)酶濃度對(duì)反應(yīng)效果的影響

圖2 羧基磁球固定化酶檢測(cè)效果Fig 2 The effectof immobilized collagenasew ith carboxyl-modified magneticm icrospheres1—marker；2—膠原蛋白；3—未加交聯(lián)劑EDC的羧基磁球固定化酶與膠原蛋白反應(yīng)作陰性對(duì)照；4—羧基磁球固定化酶與膠原蛋白反應(yīng)。

圖3 反應(yīng)酶濃度對(duì)固定化酶效果的影響Fig 3 Effectsof differentenzyme concentration on theeffectof immobilized enzyme1—marker；2—膠原蛋白；3—酶濃度0.5mg/m L；4—酶濃度1mg/m L；5—酶濃度1.5mg/m L；6—酶濃度2mg/m L；7—酶濃度2.5mg/m L。

圖3表明，隨著酶濃度的增高，固定化酶的水解反應(yīng)也越來越徹底，說明酶的濃度增加有利于酶的固定化反應(yīng)，直到酶濃度為2mg/m L時(shí)，固定化酶的水解效果最好，但是酶的濃度繼續(xù)增高時(shí)，固定化酶的水解程度不再增加，反而有少許下降，這可能是由于酶的濃度過高造成空間上的阻礙，不利于酶的固定化。于是實(shí)驗(yàn)中采用酶的反應(yīng)濃度為2mg/m L。

2.4 載酶量的測(cè)定

測(cè)定羧基修飾的磁球固定化反應(yīng)后洗液中酶的比活，取均值。測(cè)量3次固定化反應(yīng)后取平均值，參照繪制的酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算洗液中酶的濃度，可知洗下來的酶的量。具體數(shù)值見表2。

表2 羧基磁球固定化酶洗下的酶濃度Table 2 The determ ination of the concentration of immobilized collagenasew ith carboxyl-modifiedmagneticm icrospheres

由表2得出的洗下的酶的量0.574mg，酶的總量2 mg，磁球量5 g，因此磁球的載酶量為：

羧基磁球的載酶量=（2-0.574）/5×1000=285.2mg/g

據(jù)劉天金介紹，在綜合利用互聯(lián)網(wǎng)、大數(shù)據(jù)、人工智能等現(xiàn)代信息技術(shù)和裝備的前提下，傳統(tǒng)的植保工作將逐漸演變成為一種數(shù)據(jù)集中和共享的方式——在此基礎(chǔ)之上，技術(shù)融合、業(yè)務(wù)融合、數(shù)據(jù)融合都將逐步實(shí)現(xiàn)。

2.5 中草藥的抑制效果

1）所用中草藥的大規(guī)模篩選。

圖4表明，塊莖1組中藥對(duì)酶有很強(qiáng)的抑制作用，塊莖2組、塊莖3組、葉類、礦物類、果實(shí)類、全草類沒有抑制作用。

2）塊莖1組中具有抑制效果中藥的確定。

圖5表明，3種中草藥中，只有草河車對(duì)膠原酶的水解活性有抑制作用。

3 討論

圖4 各大類中藥抑制效果Fig 4 Effectsof themajor categoriesof Chineseherbals1—膠原蛋白；2—膠原酶與膠原蛋白蛋白反應(yīng)；3—塊莖1組；4—塊莖2組；5—塊莖3組；6—葉類；7—全草類；8—果實(shí)類；9—礦物類；10—膠原酶。

圖5 草河車·重樓、貓爪草·毛茛、天葵子·毛茛的抑制效果Fig 5 Effectsof Parispolyphylla Sm ith,Ranunculus ternatus Thunb and SemiaquilegiaadoxoidesMak1—marker；2—草河車（2min）；3—貓爪子（2min）；4—天葵子（2m in）；5—草河車（5m in）；6—貓爪子（5m in）；7—天葵子（5m in）；8—膠原蛋白；9—膠原酶。

高活性的膠原酶與多種疾病相關(guān)，其抑制劑在疾病治療方面具有重要的作用，針對(duì)膠原酶的活性進(jìn)行靶向治療是近年來的研究熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)對(duì)膠原酶抑制劑的研究主要集中在對(duì)常見藥物的抑制效果的測(cè)定，國(guó)外則大力開發(fā)化學(xué)合成的抑制劑，從分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的角度設(shè)計(jì)新的抑制劑和修飾已有的抑制劑。但國(guó)內(nèi)外都很少?gòu)奶烊划a(chǎn)物中嘗試尋找膠原酶的抑制成分。本研究主要從天然中草藥中尋找膠原酶抑制劑，我國(guó)在中草藥資源上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)中草資源可以推動(dòng)中藥走向國(guó)際舞臺(tái)。

本研究采用EDC作為交聯(lián)劑成功地將Ⅰ型膠原酶共價(jià)結(jié)合到羧基磁性微球上，通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)可知交聯(lián)劑EDC在固定化過程中是必要的。并且該固定化并不影響膠原酶的活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在酶的反應(yīng)濃度為2mg/m L時(shí)，固定化酶的水解效果最好。膠原酶與羧基磁球的共價(jià)結(jié)合是本研究進(jìn)行的關(guān)鍵，該技術(shù)的解決為后面膠原酶抑制劑的篩選奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于膠原酶的固定化有一定的參考價(jià)值。從傳統(tǒng)中草藥中篩選活性成分是遴選藥物分子的重要手段之一。本研究采用了一種比較快速的方法進(jìn)行篩查，即對(duì)篩選的批量中草藥進(jìn)行分組，確定有活性的中藥組后再分別進(jìn)行活性篩查。從初步的研究結(jié)果看，草河車對(duì)膠原酶有一定的抑制作用，對(duì)之后的膠原酶抑制劑研究有一定的借鑒作用。我們接下來的工作就是通過色譜分析確定草河車中哪種活性成分對(duì)膠原酶有抑制作用，并進(jìn)行相關(guān)的分析。

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Research of screening inhibitorsof collagenase immobilized by magneticm icrospheres

CHENRui,YANYue,ZHAODong-xu
（Beijing Institute of Technology,Schoolof Life Science,Beijing 100081,China）

The presentpaperused surface-modifiedmagneticm icrospheresasa carrierof collagenase immobilized by covalentbonding to screen the kindsw ith inhibition on collagenase from 56 kinds of Chinese herbals.The results showed thatcollagenase could be immobilized better in carboxyl-modifiedmagneticm icrosphereswhen the optimum concentration of enzymewas 2mg/m L.The immobilized enzyme still keptnormal activity after immobilization.The SDS-PAGE was introduced to exam the hydrolysis degree by collagenase in existence of Chinese herbalextract.Thismethod could identify quickly Parispolyphylla Sm ith w ith inhibition to collagenase from 56 kindsof Chinese herbals.

magneticm icrospheres;immobilization;collagenase;herbals;inhibitors

Q814

A

2095－1736（2015）03－0021－04

10.3969/j.issn.2095-1736.2015.03.021

2014-10-17；

2014-10-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21175011）

陳 蕊，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樯飳W(xué)，E-mail：rui618310@163.com；

趙東旭，博士，研究生導(dǎo)師，研究方向：主要生物活性成分的分離分析，E-mail:zhaodx@bit.edu.cn。