徐忠秀 曹香華 王生余 曾彩虹 朱小東 劉志紅 秦衛(wèi)松

二甲苯誘導(dǎo)大鼠腎損傷模型的建立

徐忠秀 曹香華 王生余 曾彩虹 朱小東 劉志紅 秦衛(wèi)松

目的:建立二甲苯誘導(dǎo)腎損傷的大鼠模型，觀察吸入二甲苯對大鼠腎臟損傷的病理特點。方法:選擇雄性SD大鼠，吸入二甲苯2次/d，3h/次。分別收集吸入二甲苯4、6、8、10、12周各個時間點大鼠的尿液、血清和腎組織，檢測24h尿蛋白、生化指標(biāo)和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)/肌酐;行腎組織光鏡和電鏡觀察腎小管和腎小球病變，免疫熒光染色觀察足細胞裂孔膜蛋白podocin和骨架蛋白synaptopodin表達和分布變化。結(jié)果:(1)大鼠吸入二甲苯3周開始出現(xiàn)蛋白尿，8～9周尿中蛋白量達到最高(34.78±2.91 mg/24h)，此后蛋白尿維持在一個相對恒定的水平;(2)實驗大鼠尿NAG酶在吸入二甲苯2周后開始升高，第4周增高最為顯著，并且達最高水平［25.03±4.88 U/(g·cr)］。(3)吸入二甲苯的大鼠總蛋白、白蛋白、肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶與正常對照組相比沒有顯著差異，大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶較正常對照組明顯升高;吸入二甲苯12周，血清尿素氮與正常對照組相比增高。(4)光鏡下觀察可見腎小管上皮細胞空泡變性，腎小管細胞刷狀緣脫落、扁平，部分小管上皮細胞崩解，脫落至管腔中。腎小球未見明顯異常。超微結(jié)構(gòu)觀察可見多處腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，上皮細胞崩解，線粒體腫脹，基質(zhì)電子密度降低，嵴移向周圍，變短及數(shù)量減少。腎小球足細胞節(jié)段足突融合。(5)大鼠吸入二甲苯腎組織免疫熒光染色，可見腎小球足細胞裂孔膜蛋白podocin和骨架蛋白synaptopodin熒光強度減弱，表達呈現(xiàn)不連續(xù)顆粒樣分布。

結(jié)論:成功建立了大鼠吸入二甲苯的腎損害模型，初步證實吸入二甲苯能夠?qū)е履I臟損傷，大鼠出現(xiàn)蛋白尿，腎小管上皮細胞損傷明顯，腎小球足細胞節(jié)段損傷，腎小管損傷程度明顯重于腎小球。

二甲苯大鼠蛋白尿腎小管腎小球Corresponding author:QINWeisong(E-mail:qinweisong@163．com)

近年來，由于接觸有機溶劑導(dǎo)致的腎病發(fā)病率逐年增加，這些患者均以水腫、大量蛋白尿起病，對常規(guī)的免疫抑制劑無效，部分患者在脫離接觸后，經(jīng)積極的治療后癥狀很快緩解，但也有很多患者很快進入終末期腎病(ESRD)［1］。到目前為止，對于有機溶劑引起腎臟損害的機制還不十分清楚。

有機溶劑是多種化學(xué)物質(zhì)的組成成分，具有溶解油類、脂肪類、樹脂類和纖維素的能力，廣泛用于生產(chǎn)和生活中。有機溶劑的揮發(fā)性和親脂性使其易對生物體產(chǎn)生毒性作用。有機溶劑進入人體主要是通過呼吸和皮膚接觸，可引起機體多種器官和組織損害，例如造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟和脂肪含量豐富的組織［2－5］。

在實際生產(chǎn)和生活中使用的有機溶劑大多為混合液，其中各種物質(zhì)所占的比例并不完全相同，因此有接觸史的腎臟疾病患者雖然臨床表現(xiàn)多以腎病綜合征為主［1］，但病理表現(xiàn)多種多樣，可見系膜增生性病變、膜增殖性腎炎、膜性腎病及抗腎小球基膜腎炎等［6］，也可見到腎小管損害［7］。我們既往研究證實，大鼠吸入混合有機溶劑可出現(xiàn)明顯的腎臟損害，如可出現(xiàn)蛋白尿，病理觀察可見到腎小管及腎小球足細胞出現(xiàn)不同程度損傷［8］。為了進一步研究有機溶劑導(dǎo)致腎臟損害的機制，需要建立單一一種有機溶劑腎損害的模型。

在本研究中，我們選擇二甲苯開展進一步研究。二甲苯無色透明，具有芬芳氣味，略帶甜味、易揮發(fā)，油漆、噴漆、橡膠、皮革等工業(yè)廣泛用作溶劑或稀釋劑。由于國家對油漆等材料中苯的含量制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，因此近年來油漆等有機溶劑的污染主要以二甲苯超標(biāo)為主。有研究發(fā)現(xiàn)二甲苯暴露可能會通過氧化應(yīng)激途徑引起腎小管上皮細胞壞死，最終導(dǎo)致腎衰竭［9］，但是對二甲苯引起的腎臟損害尚缺乏系統(tǒng)深入的研究。

材料與方法

動物分組和實驗設(shè)計選用4～6周齡雄性SD大鼠57只(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實驗動物中心提供)，體質(zhì)量140～160g。大鼠被隨機分為對照組(7只)和實驗組(50只)，實驗組又分為5個時間點，分別為吸入二甲苯4、6、8、10、12周，每個時間點10只大鼠。實驗期間，房間溫度恒定在25℃左右，濕度70%，晝夜交替，大鼠自由進食、飲水，保持墊料干燥。

二甲苯吸入方法實驗中我們選用兩個特制木箱(80 cm×80 cm×50 cm)，每箱放入2籠大鼠，每籠5只，籠內(nèi)放2個平皿，平皿中加入一定量的二甲苯，使其完全揮發(fā)，計算后籠內(nèi)有機溶劑二甲苯的總濃度為15 000 PPM。實驗大鼠每日吸入兩次，上下午各3h。

標(biāo)本留取每周留取大鼠24h尿和隨機尿，隨機尿用于尿蛋白定量和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)檢測。實驗終點，用氯胺酮麻醉大鼠，通過心臟穿刺，采血并置非肝素化采血管。用生理鹽水經(jīng)心臟灌洗，迅速分離出腎臟，分別留取腎組織用于光鏡、電鏡、免疫熒光觀察。分離出血清，用于生化分析。

尿液檢測

尿蛋白定量尿蛋白檢測采用雙縮脲法。具體步驟如下:(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定:取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(1mg/ml，BSA)，用水補足到1毫升，然后加入4 ml雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫(20～25℃)下放置30min，于540 nm處進行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)樣品的測定:取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。隨機尿NAG酶檢測采用對硝基苯酚比色法檢測大鼠尿樣中NAG酶的活性。NAG的活力以國際單位表示，即1L樣品中的NAG在37℃水解底物，每分鐘生成1μmol/L的對硝基苯酚相當(dāng)1μ/L。

血清生化分析采用HITACHI 7080自動生化分析儀，檢測血清總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。

腎組織病理

光鏡檢查處死大鼠，取其腎臟經(jīng)腎門冠狀面切取組織，厚約2 mm，固定，石蠟包埋，切片厚度2 μm，行HE染色。光鏡下觀察腎組織的病理改變。

電鏡檢查將腎組織標(biāo)本切成1 mm3的組織塊，用3.75%戊二醛于4℃固定4h以上。用0.1M PBS漂洗5～6次，2%鋨酸4℃固定2h，蒸餾水漂洗3～4h，丙酮脫水、浸透，然后用包埋試劑盒(SPI公司)包埋、切片。將厚80～90 nm的切片置于銅網(wǎng)上，醋酸鈾染液室溫染10～20 min，雙蒸水洗凈，濾紙吸干，Hitachi 7500透射電鏡觀察。

免疫熒光染色觀察足細胞裂孔膜蛋白podocin和骨架蛋白synaptopodin的表達，將2μm厚度的石蠟切片常規(guī)脫蠟，分別與兔抗鼠podocin(1∶200;p0372，sigma)和synaptopodin(1∶200;R34229，sigma)孵育，4℃過夜，PBS緩沖液沖洗三次，然后用FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶50;F0205，KADO)室溫反應(yīng)45 min，PBS洗滌后甘油封片觀察。

統(tǒng)計學(xué)處理計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

實驗大鼠24h尿蛋白的變化大鼠吸入二甲苯3周后開始出現(xiàn)蛋白尿，之后緩慢增加，第7周增幅最大，8～9周尿蛋白量達到最高，尿蛋白含量為(34.78±2.91)mg/24h，此后維持在一個相對恒定的水平(圖1)。

圖1 實驗大鼠24h尿蛋白定量

尿NAG酶的變化大鼠吸入二甲苯2周后尿NAG酶即開始升高，2～4周增加最為顯著，之后便維持在一個相對恒定的水平，隨觀察時間延長，尿NAG酶并未出現(xiàn)明顯變化，12周時尿NAG為(25.03±4.88)U/(g·cr)(圖2)。

圖2 實驗大鼠隨機尿NAG酶檢測

實驗大鼠生化指標(biāo)的變化二甲苯吸入組大鼠血清總蛋白、白蛋白、肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶與正常對照組大鼠相比沒有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(表1)。大鼠吸入二甲苯12周，血清尿素氮水平較正常對照組增高(P=0.028 9)。在吸入二甲苯6周、8周、10周、12周后，大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶明顯升高。

表1 實驗大鼠血清生化指標(biāo)

實驗大鼠腎組織病理變化實驗終點留取吸入二甲苯的大鼠腎組織，光鏡下可見廣泛腎小管上皮細胞空泡變性(圖3A)，近端腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、扁平，部分腎小管上皮細胞崩解，脫落至管腔中(圖3B)。光鏡觀察腎小球未見明顯異常。

超微結(jié)構(gòu)觀察可見多處腎小管上皮細胞刷狀緣脫落(圖4A)，上皮細胞崩解(圖4B)，線粒體腫脹，基質(zhì)電子密度降低，嵴移向周圍，變短及數(shù)量減少，線粒體體積增大(圖4C)，足細胞節(jié)段足突融合(圖4D)。

圖3 大鼠吸入二甲苯引起的腎臟損害(HE，×400)

吸入二甲苯對大鼠腎小球裂孔膜蛋白和骨架蛋白的影響正常大鼠腎小球足細胞裂孔膜蛋白podocin(圖5A)和骨架蛋白synaptopodin(圖6A)的表達沿血管袢呈連續(xù)線樣分布。二甲苯暴露6周、8周、10周和12周的大鼠可觀察到部分腎小球podocin和synaptopodin熒光強度減弱，表達呈不連續(xù)顆粒樣分布(圖5、6)。

圖4 二甲苯暴露大鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)觀察(EM)

圖5 實驗大鼠腎小球足細胞裂孔膜蛋白podocin的變化(IF，×400)A:正常大鼠腎臟裂孔膜蛋白podocin的分布;B:二甲苯暴露6周大鼠腎臟裂孔蛋白podocin的分布; C:二甲苯暴露8周大鼠腎臟裂孔蛋白podocin的分布;D:二甲苯暴露10周大鼠腎臟裂孔蛋白podocin的分布;E:二甲苯暴露12周大鼠腎臟裂孔蛋白podocin的分布

圖6 實驗大鼠腎小球足細胞骨架蛋白synaptopodin的變化(IF，×400)A:正常大鼠腎臟骨架蛋白synaptopodin的變化;B:二甲苯暴露6周大鼠腎臟骨架蛋白synaptopodin的變化;C:二甲苯暴露8周大鼠腎臟骨架蛋白synaptopodin的變化;D:二甲苯暴露10周大鼠腎臟骨架蛋白synaptopodin的變化;E:二甲苯暴露12周大鼠腎臟骨架蛋白synaptopodin的變化

討論

本研究建立的大鼠吸入二甲苯的腎損傷模型，其腎組織病理表現(xiàn)為腎小球和腎小管損傷。二甲苯是多種工業(yè)原料的添加劑，廣泛存在于日常生活中。已有研究初步證實二甲苯可以引起蛋白尿，但并沒有進行更深入的研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)大鼠吸入3周后開始出現(xiàn)蛋白尿，8～9周達最高水平;吸入二甲苯2周后尿液NAG酶開始升高，4周時最高，之后維持穩(wěn)定。吸入二甲苯12周后大鼠腎小管病理可見腎小管上皮細胞刷狀緣脫落、細胞崩解，脫落至管腔中，電鏡下可見線粒體腫脹。

腎臟血液供應(yīng)非常豐富，靜息狀態(tài)約占每搏量的20%，因此進入機體內(nèi)的二甲苯若不能完全經(jīng)肝臟解毒，會隨血液流經(jīng)腎臟，由于腎臟的“逆流倍增”效應(yīng)，很容易造成腎小管上皮細胞損傷［8］。腎小球濾過液會通過受損的小管上皮細胞外滲，導(dǎo)致腎皮質(zhì)受壓血供減少;與此同時，脫落至管腔的細胞殘骸以及球旁細胞分泌的血管緊張素使得管腔狹窄，從而進一步加重了腎皮質(zhì)缺血［10］。也有研究證實甲苯和二甲苯能夠影響氧化呼吸鏈的第四階段，使得線粒體解偶聯(lián)導(dǎo)致ATP耗竭，導(dǎo)致線粒體膜蛋白消散、鈣離子釋放［11］。本研究觀察到腎小管上皮細胞線粒體腫脹，可能與此機制有關(guān)。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，大鼠腎小管對于二甲苯的損傷比較敏感，在早期就開始出現(xiàn)腎小管的損傷，NAG酶在吸入二甲苯2周后開始升高，第4周為(25.03±4.88)U/(g·cr)。光鏡下可觀察到腎小管上皮細胞空泡變性，腎小管細胞刷狀緣脫落、扁平，部分小管上皮細胞崩解，脫落至管腔中，間質(zhì)中未見有浸潤細胞的存在。超微結(jié)構(gòu)觀察可見多處腎小管上皮細胞刷狀緣脫落，上皮細胞崩解，線粒體腫脹，基質(zhì)電子密度降低，嵴移向周圍，變短及數(shù)量減少。在晚期的病理切片中我們還觀察到足細胞節(jié)段足突融合。大鼠吸入二甲苯后腎組織免疫熒光染色，可見腎小球足細胞裂孔膜蛋白podocin和骨架蛋白synaptopodin熒光強度減弱，表達呈現(xiàn)不連續(xù)顆粒樣分布。這些結(jié)果表明，有機溶劑對腎小管上皮細胞的損傷明顯早于腎小球足細胞，對腎小管上皮細胞損傷的程序明顯比足細胞嚴(yán)重。吸入的有機溶劑在腎小管經(jīng)濃縮后損傷腎小管，導(dǎo)致腎小管返流，使腎小球包囊內(nèi)有機溶劑的濃度增加，從而導(dǎo)致腎小球壁層和臟層上皮細胞的損傷［12，13］，詳細機制需要進一步的深入研究。

在吸入二甲苯的大鼠模型中，血清總蛋白、白蛋白、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶與對照組相比并無明顯改變，僅在吸入二甲苯12周的大鼠中觀察到血清尿素氮較正常對照組出現(xiàn)升高。目前已有一些關(guān)于二甲苯對實驗動物毒性的報道［14－18］，如Kum等［19］觀察了二甲苯暴露對于大鼠腎臟氧化應(yīng)激及血清生化指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)短期低劑量吸入二甲苯，大鼠血清尿素氮水平明顯增高，腎組織谷胱甘肽和丙二醛活性升高。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)二甲苯能引起大鼠肝細胞線粒體解偶聯(lián)［20］。

小結(jié):我們成功建立了大鼠吸入二甲苯的腎損傷模型，大鼠在吸入二甲苯后出現(xiàn)蛋白尿，病理改變可見腎小管上皮細胞的明顯損傷，腎小球足細胞發(fā)生節(jié)段損傷，腎小管的損傷明顯重于腎小球。二甲苯引起腎臟損傷的具體機制還有待更深入的研究闡明。

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Themodel of renal injury by inhaling xylene in rats

XU Zhongxiu，CAO Xianghua，WANGShengyu，ZENGCaihong，ZHU Xiaodong，LIU Zhihong，QINWeisong
National Clinical Research Center of Kidney Disease，Jinling Hospital，Nanjing University School ofMedicine，Nanjing 210016，China

Objective:To build amodel to observe the characteristics of renal injury in rats by exposure to xylene．

Methodology:Male Sprague-Dawley rats(n=57)，weighing 140－160g，4－6 week old，were used in this study．They were randomly divided into two groups:control group(n=7)and xylene exposure group(n=50)，who were exposed to xylene six hours per day for twelve weeks．The 24h urinary protein excretion and urinary NAG levels were measured．In addition，serum total protein(TP)，albumin(Alb)，urea(BUN)，creatinine(SCr)，aspartate amino transferase(AST) and alanine amino transferase(ALT)levelswere examined．The tubular and glomerularmorphology were observed by light microscopy and transmission electronmicroscopy．The podocin and synaptopodin expression and distribution change were determined by indirect immunofluorescence staining．Results:Compared with the control rats，the proteinuria was observed in rats after xylene exposure of 3 weeks，and the amount of urinary protein excretion was increased to(34.78± 2.91)mg/24h at 8 weeks．The level of urinary NAG was increased obviously after the xylene exposure of 4weeks．After xylene exposure of12 weeks，the urinary NAG in experiment and control ratswas(25.03±4.88)U/(g·cr)and(14.36± 2.05)U/(g·cr)，respectively．No significant differenceswere found in the levels of TP，Alb，Scr and ALT．The levels ofserum urea was increased in xylene exposed rats at 12 weeks(P＜0.05)and AST was increased significantly．The histological examination bymicroscopy showed that there were remarkable injuries in proximal renal tubule，including loss of brush border and vacuolar degeneration of the epithelial cells．Ultra structural study demonstrated that brush border and cytoplasm of tubular epithelial cell were dropped and some epithelial cells were disintegrated．The mitochondria of tubular epithelial cells was swollen and the electron density was decreased in matrix．The results by immunofluorescence staining showed that distribution of podocin and synaptopodin along GBM was discontinuous and granular after xylene exposure of12 weeks．Conclusion:The present study indicates the renal injury by exposure to xylene．The severity of tubular epithelial cell damage was significantly heavier than that of podocytes．

xylene rats proteinuria tubule glomerulus

2013-11-06

(本文編輯 加則)

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)［2012CB517600(2012CB517605)］;國家自然科學(xué)基金(81270811);江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(BL2012007)

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)腎臟科碩士研究生(徐忠秀)，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心全軍腎臟病研究所(南京，210016)［通信作者］秦衛(wèi)松(E-mail:qinweisong@163．com)

2015年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有