高蘇亞，李 華，劉小麗，張 韞，楊 筱

(1.西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021；2.西北大學 分析科學研究所，陜西 西安 710069；3.長安大學 環(huán)境科學與化工學院，陜西 西安 710054)

雙醋瑞因(Diacerein，DA)屬蒽醌類藥物(二乙酰大黃酸，商品名為安必丁)，是一種新型白細胞介素1(IL-1)抑制劑，可顯著改善骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)功能，刺激轉(zhuǎn)化生長因子TGF-α的生成和軟骨基質(zhì)物質(zhì)的形成而促進軟骨修復(fù)[1-4]。目前，隨著世界骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率逐年上升，人們對DA的研究和需求日趨增多[5-7]。但DA與牛血清白蛋白(Bovin Serum Albumin，BSA)的相互作用研究鮮見文獻報道[8-9]。因此通過熒光光譜法探討了在模擬生理條件下DA與BSA的相互作用，為深入了解DA在體內(nèi)的運輸和代謝提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

BSA：相對分子質(zhì)量66 500，Sigma-Aldrich Company中國上海分部，用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液[c( NaCl)=0.1 mol/L，pH=7.40]配成c(BSA)=2.0×10-4mol/L的儲備液；DA：質(zhì)量分數(shù)>99%，西安華萃生物技術(shù)公司，用二甲亞砜配成c(DA)=1.0×10-3mol/L的儲備液，分別于4 ℃冰箱儲存。其它試劑均為國產(chǎn)市售分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

F-4500熒光光譜儀：日本日立公司；UV-2450紫外-可見分光光度計：日本島津公司；TED溫控儀：天津泰斯特儀器有限公司；PB-10酸度計：德國Sartorius集團。

1.2 實驗方法

精密移取一定量2.0×10-5mol/L BSA溶液于一系列10 mL容量瓶中，依次加入不同體積的1.0 ×10-3mol/L DA溶液，用0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖溶液定容，混勻，恒溫1 h(298、310 K)，在激發(fā)波長λex=280 nm掃描熒光光譜。保持波長差Δλ分別為15和60 nm下測定DA-BSA的同步熒光光譜，狹縫寬度均為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 DA對BSA的熒光猝滅光譜

按“實驗方法”測定 DA對BSA的熒光猝滅光譜，見圖1。

由圖1可見，BSA的熒光強度隨DA濃度的增大而減弱，即DA對BSA熒光有猝滅，其間發(fā)生相互作用。

λ/nma～i:c(BSA )=3.0×10-6 mol/L；c(DA )=(0,1.0,2.0,3.0,6.0,9.0,12.0,24.0,48.0)×10-6 mol/L；溫度T=310 K,pH=7.40圖1 DA對BSA的熒光猝滅光譜

2.2 熒光猝滅常數(shù)的測定與猝滅機理的推測

藥物分子對蛋白的熒光猝滅方式可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅，二者均符合Stern-Volmer方程[8]。由DA對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù)KSV(見表1)可知，F(xiàn)0/F隨DA濃度(即[c])的增大而逐漸增大，呈良好的線性關(guān)系，且隨著溫度升高猝滅常數(shù)減小；其猝滅速率常數(shù)Kq遠大于動態(tài)猝滅過程的最大速率常數(shù)2×1010L/mol·s[8]，則可推測DA對BSA的猝滅方式應(yīng)是形成了基態(tài)復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅。

表1 DA對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù)

2.3 采用2種方法計算DA與BSA的結(jié)合常數(shù)Kb和結(jié)合位點數(shù)n

方法Ⅰ：采用Lineweaver-Burk方程lg[(F0-F)/F]= lgKb+nlg[c]分別作298、310 K下lg[(F0-F)/F]-lg[c]的擬合曲線(見圖2a和表2)。

方法Ⅱ：采用逐級配位、由總濃度代替游離濃度的改進公式lg[(F0-F)/F] =nlgKb+nlg[[c]t-n[P]t(F0-F)/F0]，利用Excel軟件編程?？傮w思路：先令n=1，以lg[(F0-F)/F]對lg[[c]t-n[P]t(F0-F)/F0]進行線性擬合，可得到斜率n1。若擬合得到n1值與假設(shè)的n=1不相符時，則將n1值代入式中再次擬合，得斜率n2，依此往復(fù)迭代，直到在所要求的精確度下nk+1≈nk時，迭代結(jié)束。結(jié)果見圖2b。

lg[c]a

lg[[c]t- n[P]t(F0-F)/F0]b圖2 lg[(F0-F)/F]-lg[c]和lg[(F0-F)/F]-lg[[c]t-n[P]t(F0-F)/F0]關(guān)系圖

T/K方法Ⅰ方法ⅡKb /(L·mol-1)nrKb/(L·mol-1)nr2988.983×1030.97240.99271.2849×1040.96150.99363108.116×1020.82610.99359.3108×1030.81130.9932

由圖2和表2可知，2種方法的計算結(jié)果有一定的差異，這說明當藥物總濃度和生物大分子的總濃度接近時，顯然用假設(shè)游離濃度近似等于總濃度([c]f≈[c]t)的Lineweaver-Burk方程計算是不合適的，此時應(yīng)該用方法Ⅱ計算。

2.4 DA與BSA之間作用方式的推斷

當溫度變化較小時，其作用過程中的焓變ΔrHm可以看作是一個常量，由熱力學方程ln(Kb2/Kb1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R和ΔG=-RTlnKb=ΔH-TΔS可計算出不同溫度下DA與BSA作用過程中的熱力學參數(shù)ΔrGm、ΔrHm以及ΔrSm，結(jié)果列于表3。

表3 DA與BSA 結(jié)合過程的熱力學參數(shù)

由表3可知，ΔrHm< 0，ΔrGm< 0，說明DA與BSA的結(jié)合是一個放熱、自發(fā)的過程；ΔrSm>0且ΔrHm<0，說明二者之間存在疏水作用和靜電作用，且以靜電作用為主。

2.5 DA對BSA構(gòu)象的影響

保持發(fā)射波長與激發(fā)波長的差值分別為Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，掃描DA-BSA體系的同步熒光光譜見圖3，以便提供熒光功能基團色氨酸或酪氨酸附近微環(huán)境的相關(guān)信息，即蛋白微觀結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化。

λ/nma

λ/nmb a～h:c(BSA )=3.0×10-6 mol/L,c(DA )=(0,1.0,2.0,3.0,6.0,9.0,12.0,24.0)×10-6 mol/L;T = 310 K,pH=7.40；a:Δλ=15 nm；b:Δλ=60 nm圖3 DA-BSA的同步熒光光譜

由圖3b可見，λmax紅移，說明在此實驗條件下，DA與BSA發(fā)生作用時，僅影響了色氨酸殘基的微環(huán)境，進而說明DA結(jié)合到BSA的色氨酸殘基附近，導(dǎo)致BSA結(jié)構(gòu)松散，色氨酸殘基周圍的極性增加、疏水性減小。

2.6 DA與BSA之間作用距離的計算

根據(jù)F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[9]，當供能體(BSA)熒光發(fā)射光譜與受能體(DA)紫外吸收光譜有較多的重疊，且二者之間的距離不超過7 nm時，將會發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移而使熒光猝滅。根據(jù)c(BSA)∶c(DA) =1∶1時熒光光譜與吸收光譜的重疊譜圖(見圖4)和非輻射能量轉(zhuǎn)移相關(guān)公式[8]，得E=1-F/F0=0.232 8，圖4中兩光譜的重疊積分J=1.056×10-14cm3·L/mol，臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0=2.57 nm，DA與BSA之間作用距離r=3.14 nm。表明DA與BSA能夠發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移。

λ/nmc(BSA)=c(DA)=3.0 μmol/L；T=310 K,pH=7.40圖4 BSA的熒光發(fā)射光譜(a)和DA的吸收光譜(b)重疊譜圖

3 結(jié) 論

采用熒光光譜法結(jié)合Excel迭代法計算了在不同溫度下DA與BSA間的結(jié)合常數(shù)和相關(guān)熱力學參數(shù)。結(jié)果表明，DA對BSA的熒光有靜態(tài)猝滅效應(yīng)，結(jié)合位點數(shù)約為1，結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而減小，相互作用力主要是疏水和靜電作用；二者之間能夠發(fā)生F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移，結(jié)合位點靠近BSA的色氨酸殘基附近，使BSA分子的構(gòu)象發(fā)生了變化。

[ 參 考 文 獻 ]

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