Determ ination of Levam isole Hydrochloride in Levam isole Hydrochloride Powder by HPLC

Themethod for determination of levamisole hydrochloride in levamisole hydrochloride powder by HPLC was developed.The analyte was separated on C18 chromatographic column using a mobile phase of potassium dihydrogen phosphate（0.05 mol／L，pH value adjusted to 7.0 with triethylamine）－acetonitrile（80∶20），and detected at the wavelength of 214 nm.Themethod was validated for specificity，accuracy，linearity，precision and robustness.The results showed that a good linear relationship was accepted in the range of 0.1～2.0 mg／mL（R2＝0.9995），and the average recovery was 101.3%（n＝6），and the RSD value was 0.6%.Thismethod was suited to control the quality of levamisole hydrochloride powder.

levamisole hydrochloride powder；levamisole hydrochloride；HPLC

鹽酸左旋咪唑?yàn)閺V譜驅(qū)蟲藥，對(duì)牛、羊、豬、犬和雞的大多數(shù)胃腸道線蟲具有良好驅(qū)蟲活性。獸藥中有鹽酸左旋咪唑片、鹽酸左旋咪唑注射液和鹽酸左旋咪唑粉等不同劑型，其中鹽酸左旋咪唑粉收載于《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編—獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)［1］。標(biāo)準(zhǔn)中采用三氯甲烷萃取、高氯酸滴定法進(jìn)行含量測(cè)定。檢測(cè)中試劑三氯甲烷對(duì)人體有危害，對(duì)環(huán)境污染也較嚴(yán)重，且操作步驟較繁瑣；同時(shí)高氯酸滴定液能與多種藥物反應(yīng)，專屬性不高。目前相關(guān)文獻(xiàn)［2－6］報(bào)道測(cè)定鹽酸左旋咪唑含量的方法除高氯酸滴定法外，還有紫外分光光度法和高效液相色譜法。其中紫外分光光度法也易受其他藥物的影響，專屬性較差。劉素梅等［2］、曾建亭等［3］和陸興毅［6］分別報(bào)道采用HPLC法測(cè)定萬乳康、鹽酸左旋咪唑片和鹽酸左旋咪唑糖漿等制劑中鹽酸左旋咪唑的含量，但目前尚未有高效液相法測(cè)定鹽酸左旋咪唑粉中鹽酸左旋咪唑含量的報(bào)道。

本研究采用高效液相色潽法測(cè)定鹽酸左旋咪唑粉中鹽酸左旋咪唑的含量，試驗(yàn)結(jié)果表明其方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，能夠有效的控制該產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器與設(shè)備 Waters e2695高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器；METILER XP205電子天平。

1.2 試藥及試劑 鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌芳兌葹?9.9%，批號(hào)100167－201203，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；鹽酸左旋咪唑粉（規(guī)格：5%）為市場(chǎng)購(gòu)買；乙腈為色譜純?cè)噭?，水為超純水，其他試劑為分析純?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密稱取鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌愤m量，用水稀釋制成每1 mL含5μg的溶液，在200～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得出214 nm為鹽酸左旋咪唑最大吸收波長(zhǎng)，所以選擇214 nm作為該方法的測(cè)定波長(zhǎng)。結(jié)果見圖1。

圖1 鹽酸左旋咪唑的紫外光譜圖

2.2 色譜條件 Waters X－Bridge C18（5μm，4.6 mm×150 mm）色譜柱，流動(dòng)相為0.05 mol／L磷酸二氫鉀（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為7）－乙腈（80∶20）；流速為1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為10μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌?00 mg，置50 mL量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻，配制成2 mg／mL的儲(chǔ)備液。精密量取適量，用水稀釋成0.5 mg／mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取樣品適量（約相當(dāng)于鹽酸左旋咪唑50mg），置100mL量瓶中，用水溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取按照處方比例制備的不含鹽酸左旋咪唑的陰性樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 取2.3.1項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液，用水稀釋成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg／m L的系列對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y＝23598708X＋634363，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9995，即在0.1～2.0 mg／mL范圍內(nèi)，鹽酸左旋咪唑濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖2。

圖2 鹽酸左旋咪唑標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 專屬性 取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明陰性無干擾，結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 鹽酸左旋咪唑?qū)φ眨?.5mg／m L）色譜圖

圖4 陰性樣品色譜圖

2.6 耐用性

2.6.1 不同品牌和型號(hào)的色譜柱 分別選用Agilent ZORBAX SB－C18（5μm，3.0mm×250mm）、Agela Venusil MP C18（5μm，4.6 mm×250 mm）、Waters X－Bridge C18（5μm，4.6 mm×150 mm），按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見表1。

表1 耐用性試驗(yàn)結(jié)果表（不同色譜柱）

2.6.2 不同比例流動(dòng)相 流動(dòng)相0.05mol／L磷酸二氫鉀（用三乙胺調(diào)節(jié)pH值為7.0）－乙腈分別以不同比例，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果表（不同比例流動(dòng)相）

2.6.3 不同pH值 將流動(dòng)相0.05 mol／L磷酸二氫鉀－乙腈（80∶20）分別用三乙胺調(diào)節(jié)0.05 mol／L磷酸二氫鉀的pH值為6.8、7.0、7.2，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見表3。

表3 耐用性試驗(yàn)結(jié)果表（流動(dòng)相不同pH值）

結(jié)果表明，分別在不同品牌和型號(hào)色譜柱、不同比例流動(dòng)相和不同pH值流動(dòng)相的條件下，各試驗(yàn)結(jié)果雖略有不同，但均能滿足試驗(yàn)需要。

2.7 準(zhǔn)確度與精密度 取同一批號(hào)已知含量的鹽酸左旋咪唑粉（47.58 mg／g）0.5 g，精密稱定，共6份，分別加入鹽酸左旋咪唑?qū)φ掌愤m量，按2.3.2項(xiàng)下方法處理樣品后，記錄色譜圖，外標(biāo)法以峰面積計(jì)算鹽酸左旋咪唑的含量，結(jié)果表明，該方法回收率高，且重復(fù)性好。結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果表

2.8 穩(wěn)定性 取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下的一個(gè)樣品溶液，分別在0、2、4、8、12 h按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，考察樣品配制溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表

2.9 樣品測(cè)定 取5批樣品，按2.3.2項(xiàng)下方法處理樣品后，按2.1項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，外標(biāo)法以峰面積計(jì)算鹽酸左旋咪唑的含量，并將結(jié)果與非水滴定法測(cè)定結(jié)果比較，結(jié)果表明，兩種方法測(cè)定結(jié)果基本一致。結(jié)果見表6。

表6 樣品測(cè)定結(jié)果表（標(biāo)示量／%，n＝5）

3 討論與小結(jié)

原標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的高氯酸滴定法，要求試驗(yàn)條件比較苛刻，滴定時(shí)必須在非水條件下進(jìn)行。試驗(yàn)中需用三氯甲烷進(jìn)行萃取，不但操作繁瑣而且該試劑毒性大，同時(shí)萃取時(shí)間不同，力度不同，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均有一定的影響。弱堿性物質(zhì)及鹽類也均可以與高氯酸反應(yīng)，所以專屬性不高。在高氯酸滴定法檢測(cè)過程中還發(fā)現(xiàn)，該方法對(duì)輔料要求也很嚴(yán)格。當(dāng)使用淀粉為輔料時(shí)，樣品加水溶解再加入氫氧化鈉試液后，短時(shí)間內(nèi)就易產(chǎn)生糊化現(xiàn)象，使三氯甲烷不能完全萃取而影響含量測(cè)定的結(jié)果。

本研究采用水為溶劑，不但減少了有毒試劑的使用，操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，而且也不受常用輔料的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示高效液相色譜法與高氯酸滴定法相比，測(cè)定結(jié)果基本一致，并且方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好。高效液相色譜法可以用于鹽酸左旋咪唑粉中鹽酸左旋咪唑的含量測(cè)定。

［1］ 獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編—獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第二冊(cè)［S］.

［2］ 劉素梅，李華岑，韓立，等.萬乳康中鹽酸左旋咪唑含量測(cè)定方法的研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2010，44（2）：26－28.

［3］ 曾建亭，鐘小燕.HPLC法測(cè)定鹽酸左旋咪唑片的含量及溶出度［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2010，10（5）：628－629.

［4］ 徐燦輝，何維為.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸左旋咪唑片的含量［J］.藥物鑒定，2007，16（7）：12－13.

［5］ 王勇忠.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸左旋咪唑搽劑的含量［J］.海峽藥學(xué)，2007，19（12）：52－53.

［6］ 陸興毅.HPLC法測(cè)定鹽酸左旋咪唑糖漿的含量［J］.藥物分析雜志，2008，28（10）：1753－1754.

（編輯：侯向輝）

WANG Li1，LIU Su－mei1，ZANG He－ying1，ZHAO Chen－yu2，HAN Li1，QIU Tian－bao1
（1.Henan Province Institute of Veterinary Drug and Feed Control，Zhengzhou 450008，China；2.Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）