包潔華，張金霞，郭強(qiáng)功，張萍

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

高效液相色譜法測(cè)定酒石酸泰樂(lè)菌素有關(guān)物質(zhì)的研究

包潔華，張金霞?，郭強(qiáng)功，張萍

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

依據(jù)歐洲藥典討論稿中酒石酸泰樂(lè)菌素有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，在280 nm波長(zhǎng)處，以pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液－乙腈－水（10∶27.5∶62.5，V／V）為A流動(dòng)相，以pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液－水－乙腈（10∶40∶50，V／V）為B流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，并對(duì)專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限和定量限、線(xiàn)性和范圍、耐用性、及溶液穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，雜質(zhì)A、N、O、R、S峰峰面積與其對(duì)應(yīng)濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，各項(xiàng)考察指標(biāo)均符合要求。結(jié)果證明該分析方法能科學(xué)、合理的分析、控制酒石酸泰樂(lè)菌素有關(guān)物質(zhì)，可以持續(xù)、準(zhǔn)確地反映酒石酸泰樂(lè)菌素的特性。

高效液相色譜法；酒石酸泰樂(lè)菌素；梯度洗脫；有關(guān)物質(zhì)

酒石酸泰樂(lè)菌素是一種畜禽專(zhuān)用抗感染和促生長(zhǎng)的抗生素［1］，屬大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，主要對(duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性球菌、厭氧菌及軍團(tuán)菌、支原體及衣原體有良好效果［2］。廣泛應(yīng)用于雞、牛、羊、豬的感染性疾病?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》中利用液相色譜法測(cè)定酒石酸泰樂(lè)菌素組分［3］，有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法尚無(wú)報(bào)道，產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)定性不全面。然而，隨著科技不斷進(jìn)步和國(guó)際市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)日益劇烈，對(duì)獸用抗生素的質(zhì)量已經(jīng)不再單一要求高組分和高含量，對(duì)產(chǎn)品中的雜質(zhì)和殘留已經(jīng)越來(lái)越受到廣泛關(guān)注。由于抗生素發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)菌培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物的組分非常復(fù)雜，使用一般的液相色譜法進(jìn)行分析時(shí)，雖然主要組分可以在相對(duì)比較短的時(shí)間內(nèi)分離完畢，但有一些雜質(zhì)組分往往得不到充分洗脫。本文參考?xì)W洲藥典（EP）［4］和美國(guó)藥典（USP）［5］，研究并確立了梯度洗脫高效液相色譜法測(cè)定酒石酸泰樂(lè)菌素中的有關(guān)物質(zhì)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀（島津LC－2010AHT）、CWA－VN3超純水機(jī)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、BSA224s電子分析天平（德國(guó)賽多利斯）。

1.2 試劑

1.2.1 酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：FOD333，來(lái)源：美國(guó)藥典委員會(huì)）、酒石酸泰樂(lè)菌素（批號(hào)：A91140702，由寧夏泰瑞制藥股份有限公司提供）、磷酸氫二鉀（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、乙腈（色譜純）。

1.2.2 pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液 取27.22 g磷酸二氫鉀于適量水中溶解，并用水稀釋至1000mL，再用34.84 g／L的磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至5.5±0.1。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜條件 島津LC－2010高效液相色譜儀，末端封尾C18色譜柱，規(guī)格4.6 mm×250 mm× 5μm，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)280 nm，柱溫60℃［4］，流速1.0 mL／min，以pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液－乙腈－水（10∶27.5∶62.5，V／V／V）為A流動(dòng)相，以pH 5.5的磷酸鹽緩沖溶液－水－乙腈（10∶40∶50，V／V／V）為B流動(dòng)相，梯度洗脫［6］程序如表1。

表1 梯度洗脫流動(dòng)相比例變化

2.2 專(zhuān)屬性

2.2.1 空白溶液 流動(dòng)相、水。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取供試品25.0 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，用流動(dòng)相B溶解并定容至刻度，搖勻后用0.45μm濾球過(guò)濾。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 對(duì)照溶液（a）：精密稱(chēng)取5 mg酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品（包含泰樂(lè)菌素A，B，C和D組分，以及雜質(zhì)A，N，O，R和S）用流動(dòng)相B溶解并稀釋至5.0mL，搖勻后用0.45μm濾球過(guò)濾。

對(duì)照溶液（b）：準(zhǔn)確移取1.0 mL供試品溶液置量瓶中，用水稀釋至100.0mL，再取1.0mL該溶液用水稀釋至10.0mL，搖勻后用0.45μm濾球過(guò)濾。

2.2.4 測(cè)定 精密量取空白溶液、對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至泰樂(lè)菌素A組分保留時(shí)間的1.4倍（圖1）?？瞻兹芤簩?duì)供試品雜質(zhì)沒(méi)有干擾，同時(shí)供試品中雜質(zhì)峰的相對(duì)保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品中雜質(zhì)峰的相對(duì)保留時(shí)間一致（表2）。

圖1 專(zhuān)屬性考察色譜圖

表2 專(zhuān)屬性考察數(shù)據(jù)

2.3 準(zhǔn)確度 稱(chēng)取酒石酸泰樂(lè)菌素供試品25.0mg置于50 mL量瓶中，用流動(dòng)相B溶解并定容至刻度，精密量取20μL注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣2次，記錄色譜圖至泰樂(lè)菌素A峰保留時(shí)間的1.4倍。分別稱(chēng)取酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品4、5、6mg置10mL量瓶中，用供試品溶液溶解并定容至刻度，相對(duì)濃度為80%、100%、120%。分別精密量取各溶液20μL注入高效液相色譜儀，各進(jìn)樣3次，記錄色譜圖至泰樂(lè)菌素A峰保留時(shí)間的1.4倍。然后計(jì)算三個(gè)濃度下（80%、100%、120%）測(cè)試雜質(zhì)的面積，測(cè)試結(jié)果及計(jì)算回收率結(jié)果見(jiàn)表3。三個(gè)濃度下（80%、100%、120%）測(cè)試雜質(zhì)A、N、O、R、S面積回收率均在80%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10.0%。

2.4 精密度 分別稱(chēng)取酒石酸泰樂(lè)菌素供試品20.0、25.0、30.0mg，分別置于3個(gè)25mL量瓶中，用流動(dòng)相B溶解，制備出濃度為80%、100%、120%的供試品溶液，同法制備3個(gè)濃度共9個(gè)供試品溶液，分別編號(hào)為1、2、3。精密量取各溶液20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖至泰樂(lè)菌素A峰保留時(shí)間的1.4倍。按峰面積歸一化法計(jì)算三個(gè)濃度下（80%、100%、120%）測(cè)試選定雜質(zhì)的允許差（即極差值），測(cè)試結(jié)果及計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。三個(gè)濃度下（80%、100%、120%）測(cè)試選定雜質(zhì)的允許差（即極差值）均不大于0.10%。

表3 供試品五種雜質(zhì)A、N、O、R、S回收率結(jié)果

表4 五種雜質(zhì)A、N、O、R、S重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

2.5 檢測(cè)限和定量限

2.5.1 供試品溶液制備 稱(chēng)取5 mg酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品用流動(dòng)相B溶解并稀釋至5.0 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液1（可以使用當(dāng)日系統(tǒng)適用性溶液），編號(hào)為1，依次2倍稀釋至雜質(zhì)A，N，O，R和S中最大雜質(zhì)信噪比接近10∶1及3∶1（稀釋溶液依次編號(hào)為2、3、4…n），備用。

2.5.2 精密量取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1、2、3、4…n）各20μL注入高效液相色譜儀，各進(jìn)樣1次，記錄色譜圖。分別計(jì)算色譜圖中對(duì)應(yīng)峰信號(hào)響應(yīng)值與空白溶液信號(hào)響應(yīng)值的比值。計(jì)算以雜質(zhì)A、N信噪比約為3∶1時(shí)的溶液濃度為0.03125 mg／m L即為檢測(cè)限，雜質(zhì)O、R、S信噪比約為3∶1時(shí)的溶液濃度為0.06250 mg／mL即為檢測(cè)限，雜質(zhì)A、O信噪比約為10∶1時(shí)的溶液濃度0.25 mg／m L即為定量限，雜質(zhì)N、R、S信噪比約為10∶1時(shí)的溶液濃度0.125 mg／mL即為定量限。

2.6 線(xiàn)性和范圍 稱(chēng)取酒石酸泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品60.0 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，濃度為1.2 mg／mL，作為供試品溶液。分別吸取供試品溶液1.0、7.9、5.8、4.6、2.1、1.0 mL，配制成1.2、0.95、0.7、0.55、0.25、0.125 mg／mL濃度的線(xiàn)性溶液，按系統(tǒng)色譜條件檢測(cè)，記錄各雜質(zhì)峰的峰面積。以雜質(zhì)峰的峰面積對(duì)應(yīng)供試品濃度做回歸曲線(xiàn)，數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 五種雜質(zhì)A、N、O、R、S的線(xiàn)性曲線(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果

2.7 耐用性和溶液穩(wěn)定性考察 通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相流速1.00±0.05 mL／min、波長(zhǎng)280±2 nm、pH值5.5±0.1，對(duì)雜質(zhì)A、N、O、R、S進(jìn)行檢查，結(jié)果的允許差均不大于0.10%。說(shuō)明微小改變色譜條件適用于這五種雜質(zhì)的檢測(cè)。對(duì)溶液穩(wěn)定性進(jìn)行考察，標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液分別在常溫放置0、12、24、48、60、72 h，取臨用新配標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定的結(jié)果允許差（即極差值）均不大于0.10%。

3 討論與小結(jié)

本文參照歐洲藥典討論稿中酒石酸泰樂(lè)菌素有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法，討論稿中包括的雜質(zhì)有A、N、O、R、S、E、G、H、I、J、Q共11種，本文中只對(duì)A、N、O、R、S進(jìn)行了考察，其余雜質(zhì)有待進(jìn)一步考察。

歐洲藥典討論稿中試樣溶解用乙腈和水，梯度洗脫程序是0～25 min，流動(dòng)相A 100%洗脫，25～45 min流動(dòng)相A為100→84，流動(dòng)相B為0→16，45～65 min時(shí)流動(dòng)相A為84%，B為16%保持恒定，洗脫過(guò)程中色譜峰雜質(zhì)的分離度達(dá)不到要求［3］（R≥1.5），調(diào)整梯度洗脫程序?yàn)?～20 min，流動(dòng)相A 100%洗脫，20～45 min流動(dòng)相A為100→84，溶劑調(diào)整為流動(dòng)相B后色譜分離效果良好，不會(huì)產(chǎn)生因?yàn)槿軇┡c流動(dòng)相不一致或者是相溶性差而導(dǎo)致的樣品析出再二次溶解的問(wèn)題，避免出現(xiàn)色譜峰對(duì)稱(chēng)性差甚至分叉的問(wèn)題。

試驗(yàn)中對(duì)室溫、30、40、50℃等條件進(jìn)行了考察，色譜圖出峰時(shí)間延長(zhǎng)，且柱壓明顯升高。另外，方法中對(duì)耐用性進(jìn)行考察，包括調(diào)整流速1.00±0.05 mL／min、波長(zhǎng)280±2 nm、pH值5.5± 0.1，結(jié)果的允許差均不大于0.10%。說(shuō)明微小改變色譜條件適用于酒石酸泰樂(lè)菌素有關(guān)物質(zhì)A、N、O、R、S的檢測(cè)。

酒石酸泰樂(lè)菌素的生產(chǎn)中除A、B、C、D組分外，雜質(zhì)組分多，采用梯度洗脫能使雜質(zhì)組分得到強(qiáng)有力的分離。

關(guān)于酒石酸泰樂(lè)菌素有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法目前沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，本文建立了酒石酸泰樂(lè)菌素五種雜質(zhì)A、N、O、R、S的檢測(cè)方法。五種雜質(zhì)A、N、O、R、S在測(cè)定中均能獲得良好的線(xiàn)性曲線(xiàn)，該方法專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度好，對(duì)更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量具有一定的實(shí)用價(jià)值。

［1］ 酒石酸泰樂(lè)菌素［Z］.農(nóng)村養(yǎng)殖技術(shù)，2012，（9）.

［2］ 李樹(shù)綱，于清偉，張蕾，等.濁度法測(cè)定酒石酸泰樂(lè)菌素可溶性粉效價(jià)研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2012，31（2）：33－35.

［3］ 中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二○一○年版（二部）［S］.

［4］ The Directorate for the Quality of Medicines＆Health Care of the Council of Europe（EDQM）.European Pharmacopoeia［S］.

［5］ The United States Pharmacopeial Convention.U.S.Pharmacopoeia，37th Revision［S］.

［6］ 張玉奎，王杰，張維冰，等.實(shí)用高效液相色譜法的建立［M］北京：華文出版社；2001：413－414.

（編輯：陳希）

Determ ination of Tylosin Tartrate Related Substances by HPLC

BAO Jie－h(huán)ua，ZHANG Jin－xia?，GUO Qiang－gong，ZHANG Ping
（Ningxia TaiRui Pharmaceutical Co.，Ltd，Yinchuan 750101，China）

The determination method of tylosin tartrate related substances from EP discussion draft，At the wavelength of 280 nm，pH 5.5 phosphate buffer solution－acetonitrile－water（10∶27.5∶62.5，V／V）as the mobile phase A，pH 5.5 phosphate buffer solution－water－acetonitrile（10∶40∶50，V／V）as themobile phase B gradient elution，and the specificity，accuracy，precision，limit of detection and limit of quantification，linearity and range，durability，and solution stability was investigated.The results showed that the impurity A，N，O，R，S peak area and the corresponding concentration showed a linear relationship，the correlation coefficient r was greater than 0.999，the indicators are in line with inspection requirements.It was demonstrated that the method can scientific，reasonable analysis，control of tylosin tartrate related substances，It can be sustained，accurately reflect the characteristics of tylosin tartrate.

HPLC；tylosin tartrate；gradient elution；relevance substance

2014－10－29

A

1002－1280（2015）02－0035－05

S859.796

包潔華，從事抗生素生產(chǎn)質(zhì)量管理工作。

張金霞。E－mail：371226727＠qq.com