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        高效液相色譜法測定小鼠血清中磺胺間甲氧嘧啶及其N4-乙?;x物含量

        2015-06-09 22:01:13張強張丹劉業(yè)好盛杰陳文軍王國秀劉開永
        中國獸藥雜志 2015年2期
        關鍵詞:小鼠血清標準

        張強,張丹,劉業(yè)好,盛杰,陳文軍,王國秀,劉開永

        (安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,合肥230601)

        高效液相色譜法測定小鼠血清中磺胺間甲氧嘧啶及其N4-乙酰化代謝物含量

        張強,張丹,劉業(yè)好,盛杰,陳文軍,王國秀,劉開永?

        (安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,合肥230601)

        磺胺間甲氧嘧啶(SMM)于ICR小鼠哺乳期暴露后,測定其血清中SMM和N4-乙?;前烽g甲氧嘧啶(ACSMM)含量。小鼠哺乳期以0、10、50、200 mg/(kg·d)灌胃給藥直至21 d,于第22天麻醉,摘眼球取血。血清樣品經乙腈沉淀蛋白,超聲輔助提取,采用反相C18(250 mm× 4.6 mm,5μm)色譜柱,以乙腈:水(含0.2%冰乙酸)為流動相,流速為1 mL/min,柱溫35℃,高效液相色譜耦合二極管陣列檢測器對目標物檢測,SMM和ACSMM檢測波長分別為273 nm和267 nm,外標法峰面積定量。SMM和ACSMM血清加標回收率為85.8%~110.2%,精密度(RSD%)均小于8.3%,在0.05~2.5μg/mL和5~30μg/mL(適用母鼠體內SMM)范圍內與峰面積呈良好的線性關系,r2>0.990;最低檢出限分別為0.023和0.042μg/mL。本法靈敏、快速、準確,可用于血清中SMM和ACSMM的測定。

        磺胺間甲氧嘧啶;N4-乙?;前烽g甲氧嘧啶;高效液相色譜;二極管陣列檢測器

        磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine,SMM)是長效磺胺類獸藥(Sulfonamides,SAs)中的一員,研究表明SAs(包含SMM)在地表水、蔬菜、魚肉制品和牛奶等中均有檢出,甚至部分食品存在超標[1-4]?;前匪幠芡ㄟ^乳汁分泌,藥物在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏的新生兒中導致溶血性貧血發(fā)生,還可導致膽紅素腦病和新生兒溶血[5]?;前奉愃幬锛捌湟阴;x物在酸、中性環(huán)境中易在泌尿系統(tǒng)形成結晶,引起尿痛、血尿、尿閉等[6]。研究證明磺胺類抗菌藥物是一種甲狀腺素干擾物,可損傷甲狀腺濾泡細胞的粗面內質網,從而影響甲狀腺球蛋白的合成與分泌[7-9]。目前關于SMM代謝產物的液相色譜檢測報道較少[10],國內目前所報道的也僅限于SMM原形藥的殘留檢測且具有不確定性[11]和代謝動力學探討[12]。本研究擬建立方便快捷的色譜學方法,測定SMM哺乳期長期暴露后母體及子代血清SMM及ACSMM含量,為其在特殊人群體內暴露的風險評估提供數據。

        1 材料與方法

        1.1 材料 SPF級ICR小鼠(8周齡;雄性體重28~30 g,雌性體重24~26 g)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號:SCXK(京)2012-0001)。

        1.2 儀器與試劑 島津LC-20A高效液相色譜儀,光電二極管陣列檢測器(PDA-5500);高速離心機(5417R),德國Eppendorf公司;純水儀(DZG-303A),安徽皖儀科技股份有限公司?;前烽g甲氧嘧啶標準品(CAS:1220-83-3,批號:00817),含量>98.5%,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;N4-乙酰化磺胺間甲氧嘧啶標準品(CAS:4049-01-8,批號:003-096),含量>98.9%,上海Carlow化學試劑有限公司;乙腈,色譜純,美國Tedia公司;冰乙酸,分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

        1.3 動物處理 實驗前適應性喂養(yǎng)1周,飲食自由,晝夜均衡,溫度23~25℃,濕度45%~55%。24只雌鼠按雌雄比2∶1交配受孕,孕鼠正常喂養(yǎng)至自然分娩,將母鼠分為對照組、低、中、高劑量暴露組,分娩后第1天母鼠灌胃給予0、10、50和200 mg/kg SMM(溶于生理鹽水),正常飼喂21 d,第22天麻醉母鼠和子鼠后,摘除眼球取血,3500 r/min離心10 min,吸上清,保存于-20℃冰箱,待測。

        1.4 方法

        1.4.1 色譜條件 Luna C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm,Phenomenex Inc,USA);乙腈:水(含0.2%冰乙酸)=25∶75為流動相:檢測波長:267 nm(ACSMM)和273 nm(SMM);流速1 mL/min;柱溫35℃;進樣量20μL。

        1.4.2 標準溶液的配制 混合標準溶液:分別準確稱取磺胺間甲氧嘧啶和N4-乙?;前烽g甲氧嘧啶0.0100 g,甲醇溶解,轉移至10 mL容量瓶,定容至刻度,搖勻,配成各組分質量濃度為1mg/mL的混合標準溶液。以流動相稀釋母液配制系列濃度為0.05、0.5、0.625、1.25和2.5μg/mL的標準工作液。由于母鼠體內SMM濃度較高,單獨配制5、10、15、20和30μg/mL的標準系列濃度。

        1.4.3 樣品前處理 吸取0.2 mL血清于2 mL離心管中,加入0.6 mL乙腈,渦旋振蕩1 min,超聲輔助提取10min,再渦旋振蕩1min,15000 r/min離心10 min,取上清液經0.22μm有機濾膜過濾,收集濾液待測。

        1.5 方法學考察

        1.5.1 標準曲線 取空白血清加入適量SMM和ACSMM標準溶液,得混合液系列濃度:0.05、0.5、0.625、1.25和2.5μg/m L,進行HPLC分析后,以峰面積為縱坐標,系列標準濃度為橫坐標,進行線性回歸分析。僅作母鼠體內SMM含量測定的單個標準品添加濃度系列為5、10、15、20和30μg/m L。

        1.5.2 精密度與回收率 空白血清添加SMM和ACSMM標準品,使混合物終濃度為0.5、1.0和2.5μg/mL,每個濃度重復3個樣品,然后以1.4.3項樣品處理方法進行前處理及測定,依據標準曲線,計算實測濃度、回收率和精密度。

        1.5.3 靈敏度 通過加標試驗,以0.5μg/mL的添加濃度進樣3次,以信噪比RSN等于10來計算最低定量限(LOQ),以RSN等于3計算最低檢測限(LOD)。

        2 結果

        2.1 方法學驗證

        2.1.1 檢測波長的選擇 用200~400 nm檢測波長對2.5μg/mL的混合標準液進行了掃描。結果發(fā)現2個化合物最大吸收波長并不一致,為了提高方法的靈敏度,保證目標化合物都能在各自最大吸收波長下檢測,因此實驗采用多波長檢測,由圖1可以看出,SMM最大吸收波長是273 nm,ACSMM最大吸收波長是267 nm。

        圖1 SMM(左)和ACSMM(右)的最大吸收波長光譜圖

        2.1.2 色譜條件的選擇 在1.4.1項條件下,SMM和ACSMM標準品和血清添加均得到了很好的分離,前者保留時間為9.105 min,后者為7.834 min(圖2)。

        圖2 SMM和ACSMM標準品色譜圖(濃度2.5μg/m L)

        圖3 空白小鼠血清色譜圖

        圖4 小鼠血清添加SMM和ACSMM混合標準品(0.5μg/m L)色譜圖

        2.1.3 樣品提取 經過反復試驗,用0.6 mL乙腈一次提取,可將目標分析物提取出來,且小鼠空白血清和標準品添加色譜圖比較,分離度較好,目標色譜峰處無干擾(圖3~圖5)。

        2.1.4 標準曲線 線性回歸方程分別為:SMM:y=87230x-4292.3,r2=0.9993;y=35624x+27528(r2=0.9989,僅用于母鼠體內SMM計算);ACSMM:y=82870x-724.33,r2=0.9974。在實驗初期,用一條混合標準添加濃度做標準曲線時,由于SMM及代謝物在母鼠和仔鼠濃度范圍跨度較大,為兼顧代謝物計算的誤差產生,通過繪制雙標準曲線來計算目標物濃度。從上述數據可看出本方法在各自濃度范圍內線性關系良好。

        2.1.5 精密度和回收率 經過3次添加回收率測定,方法的回收率SMM:85.8%~110.2%,ACSMM:88.2%~106.3%,精密度(RSD%)均小于8.3%,可以用于檢測血清中的SMM和ACSMM。

        2.1.6 方法靈敏度 經信噪比測試,靈敏度值如下:SMM,LOD=0.012μg/mL,LOQ=0.023μg/mL;ACSMM,LOD=0.018μg/mL,LOQ=0.042μg/mL。表明該測定方法的靈敏度較好。

        2.2 樣品測定 利用本法,對1.3項的血清樣品進行測定,SMM及ACSMM濃度見表1。

        圖5 小鼠實際樣品血清色譜圖

        表1 母鼠和子鼠血清SMM和ACSMM濃度(s,n=6)

        表1 母鼠和子鼠血清SMM和ACSMM濃度(s,n=6)

        組別 SMM/(μg·mL-1)ACSMM/(μg·mL-1)母鼠子鼠母鼠子鼠SMM 0 mg/kg 0 0 0 0 SMM 10 mg/kg 3.28±0.74 0.49±0.09 0.13±0.02 0.06±0.07 SMM 50 mg/kg 10.82±0.66 0.80±0.16 0.77±0.14 0.48±0.12 SMM 200 mg/kg 24.79±3.92 1.97±0.81 1.72±0.30 0.77±0.29

        由表1可知,對照組未檢出SMM及ACSMM,當母鼠SMM灌胃劑量以倍數增加時,母鼠和子鼠血清的SMM和ACSMM并不以倍數關系增加。

        3 討論與小結

        本文建立了長效獸藥磺胺間甲氧嘧啶及其乙?;x物的高效液相色譜耦合二極管陣列檢測器的快速檢測方法。本法采用乙腈直接沉淀蛋白,超聲輔助提取,既加快了預處理的速度,又縮短了SMM及ACSMM提取的時間,且雜質干擾較小。本方法的優(yōu)勢在于所用儀器、試劑、前處理方法均較簡單、常見。試驗中曾用二氯甲烷提取時,血清中脂肪漂浮在提取溶劑表面,傾倒困難;使用偏磷酸-甲醇作提取溶劑,由于含有大量的水分,造成減壓蒸餾耗時費力;使用乙酸乙酯提取效率最高,但提取的組織內源性物質也最多,凈化較困難;本實驗也嘗試用waters HLB固相萃取小柱凈化,盡管樣品基質的去除較為滿意,但是ACSMM的回收率偏低。最后采用乙腈作提取溶劑,提取效率較高,再輔助超聲提取,可獲得滿意的回收率,另外用乙腈提取時共提的雜質也較少。

        方法的精密度和準確度均能夠滿足SMM及其代謝物ACSMM的限量檢測要求,且具有較高的實用性,有利于推廣普及,為后續(xù)研究食品中磺胺類獸藥殘留的檢測提供了基礎。Furusawa報道了SMM及代謝物在雞血漿中的測定,其血清標準添加的高濃度回收率均小于90%,而精密度與本實驗基本相同。就ACSMM測定的靈敏度而言,本實驗最低定量限低于報道的色譜學方法(0.09μg/mL)[13]。

        SMM在人體內為長效類藥物,口服半衰期超過24 h,而SMM有效血藥濃度維持時間在動物體內差異很大,多數消除半衰期維持在2~7 h[14]。從本實驗的濃度數據可以看出,盡管母鼠暴露高劑量的SMM,但是ACSMM在母子鼠體內濃度較低,而且原形藥濃度也較低。本實驗中ICR小鼠長期暴露SMM后測得的母鼠和子鼠血清中的SMM及ACSMM含量,提示SMM在人和動物體內代謝的差異很大,在磺胺類獸藥進行安全風險評估時要考慮種屬間的差異。

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        [14]吳俊偉,饒勇,姜波.磺胺間甲氧嘧啶混懸注射液在豬體內的藥動學研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2007,38(7):718-722.

        (編輯:侯向輝)

        Determ ination of Sulfamonomethoxine and Its N4-acetyl M etabolite in M ice Serum by HPLC

        ZHANG Qiang,ZHAGN Dan,LIU Ye-h(huán)ao,SHENG Jie,CHENWen-jun,WANG Guo-xiu,LIU Kai-yong?
        (School of Public Health,AnhuiMedical University,Hefei 230601,China)

        Determination of sulfamonomethoxine(SMM)and N4-acetyl metabolite(ACSMM)in ICR mice exposed to SMM during lactation.The lactational mice were orally administered with SMM(0,10,50,200 mg/(kg·d)for 21 d,the mice were anesthetized and then taken blood by removalling eyeball.Following serum protein precipitation with acetonitrile,the ultrasonic-assisted extraction of the targets,separation of them were carried out on a reversed-phase C18(250 mm×4.6mm,5μm)column,themobile phase was involved in acetonitrile and 0.2%acetic acid in water,the flow rate was 1 mL/min and the column temperature was 35℃,the high performance liquid chromatographywas coupled with a diode array detector,detection wavelength of SMMand ACSMM were 273 and 267 nm respectively,and quantified with external standard method.The recoveries of SMM and ACSMM spiked in serum were 85.8%~110.2%,RSD s less than 8.3%were obtained,the linear range was 0.05~2.5μg/mL,but 5~30μg/mL suitable for SMM in the dams,and showed a good linear relationship(r2>0.990).The limit of quantitation(LOQ)was 0.023 and 0.042μg/mL respectively.This method was sensitive,rapid,accurate,can be used for the determination of SMM and ACSMM in serum.

        sulfamonomethoxine;N4-acetyl sulfamonomethoxine;high performance liquid chromatography;diode array detector

        2014-12-01

        A

        1002-1280(2015)02-0027-05

        S859.83

        國家自然科學基金項目(81202209);安徽省高等學校優(yōu)秀青年人才基金(2012SQRL075ZD);安徽醫(yī)科大學中青年學術骨干資助基金(2012051)

        張強,碩士在讀,從事食品衛(wèi)生學研究。

        劉開永。E-mail:liukaiyong163@163.com

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