董棟，商軍，錢曉璐，田愷

豬源糞腸球菌的基因型及耐藥性分析

董棟1，2，商軍1?，錢曉璐1，田愷1

（1.上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103；2.上海海洋大學(xué)，上海201306）

為了解上海地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)中糞腸球菌的耐藥性和基因型，2013年3月－2014年5月從上海地區(qū)10個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)收集到分離鑒定的糞腸球菌133株，采用微量肉湯稀釋法對(duì)12種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用PCR技術(shù)分別檢測(cè)分離株中β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥相關(guān)基因（TEM）、氨基糖苷類抗生素耐藥相關(guān)基因［aac（6’）／aph（2”）和aph（3’）－Ⅲ和ant（6）－Ⅰ］、四環(huán)素耐藥相關(guān)基因（tetM）、紅霉素耐藥相關(guān)基因（ermB和mefA）和萬古霉素耐藥相關(guān)基因（vanA和vanB）。結(jié)果顯示，在133株糞腸球菌中，耐藥基因ermB、tetM、TEM、ant（6）－Ⅰ、aac（6’）／aph2”、aph（3’）－Ⅲ、vanA的檢出率分別為：95.5%（127／133）、91.0%（121／133）、63.2%（84／133）、45.9%（61／133）、42.1%（56／133）、24.1%（32／133）、3.0%（4／133）；未檢出mefA和vanB基因的菌株。分離菌株對(duì)12種抗菌藥物的耐藥性較為嚴(yán)重，且以6～9耐為主要耐藥株，占81.2%。試驗(yàn)表明，上海地區(qū)豬源糞腸球菌多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，攜帶抗菌藥物相關(guān)耐藥基因是導(dǎo)致分離株耐藥的主要原因。

糞腸球菌；耐藥性；基因型；抗菌藥物

糞腸球菌球是一種重要的機(jī)會(huì)致病菌，在自然界中廣泛分布，常棲居于人和動(dòng)物的腸道中。糞腸球菌可導(dǎo)致人和動(dòng)物多個(gè)臟器的感染，包括尿路感染、皮膚軟組織感染、盆腔感染、腹腔感染、傷口感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎和腦膜炎［1－2］。由于其質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和突變株的發(fā)生，糞腸球菌易被誘導(dǎo)產(chǎn)生新的耐藥性，對(duì)許多抗菌藥物可產(chǎn)生獲得性耐藥，如對(duì)高水平的β－內(nèi)酰胺、氨基糖苷、糖肽類（萬古霉素）、四環(huán)素、紅霉素、利福平和氯霉素容易產(chǎn)生獲得性耐藥［3］。隨著獸醫(yī)臨床上抗菌藥物被廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致糞腸球菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，甚至對(duì)多種抗菌藥物同時(shí)耐藥的多重耐藥菌株也屢見不鮮，細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和耐藥細(xì)菌的感染常使經(jīng)驗(yàn)性治療難以奏效，近年來，豬感染糞腸球菌發(fā)病和死亡的報(bào)道也越來越多［4－6］，給獸醫(yī)臨床抗感染治療帶來極大的挑戰(zhàn)，對(duì)動(dòng)物和人類的健康造成嚴(yán)重威脅。而糞腸球菌是表示抗菌藥物耐藥性水平的一種革蘭氏陽(yáng)性指示菌，因此有必要對(duì)豬源分離糞腸球菌的耐藥性和基因型進(jìn)行分析和研究，可為科學(xué)制定抗菌感染的防治方案及細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)提供必要的理論依據(jù)。為此對(duì)從上海地區(qū)10個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)分離得到的133株糞腸球菌進(jìn)行了研究分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2013年3月－2014年5月從上海地區(qū)6個(gè)區(qū)縣10個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)肛門樣本中分離得到的糞腸球菌133株；質(zhì)控菌株：糞腸球菌ATCC 29212，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心。所有菌株置于20%甘油肉湯中，－20℃保存。

1.2 試劑與試藥 凍干型細(xì)菌定量藥敏（MIC）測(cè)試盒及MH肉湯，天津市金章科技發(fā)展有限公司；9700 PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)AB公司；PCR引物合成、相關(guān)試劑、試劑盒及蛋白酶K，上海英駿公司；GelDoc 2000凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國(guó)BIO－RAD公司；低溫離心機(jī)，德國(guó)Beckman公司；VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套細(xì)菌鑒定卡（GN卡），法國(guó)生物梅里埃公司；普通營(yíng)養(yǎng)肉湯及營(yíng)養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；腸球菌顯色瓊脂，美國(guó)BD公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣 以滅菌棉簽拭子采豬肛門樣品，置入運(yùn)送培養(yǎng)基中，保存時(shí)間不超過48 h。每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采30～50份拭子樣本，共400份樣本。

1.3.2 糞腸球菌分離，純化與鑒定 取拭子樣品用接種棒直接接種于腸球菌顯色瓊脂平板，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，挑取黑色帶光澤的可疑菌落、顯色瓊脂上純化一代。純化后可疑菌落接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純化，（36±1）℃培養(yǎng)16～18 h。對(duì)于已純化的菌落采用生物梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定出133株。

1.3.3 藥敏試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和藥敏結(jié)果結(jié)果判斷［7－9］。直接從過夜不超過24 h培養(yǎng)的平板上挑取3～5個(gè)純新鮮菌落，均勻懸浮于1.5 mL細(xì)菌稀釋管中，再將該菌液調(diào)整于0.5麥?zhǔn)蠞舛?，使菌液的?xì)菌含量1×108CFU／mL，然后稀釋為1×105～2×105CFU／mL左右，接種于含不同藥物濃度的96孔凍干型細(xì)菌定量藥敏（MIC）測(cè)試盒中，（36±1）℃溫箱中培養(yǎng)16～20 h，按同法做糞腸球菌ATCC 29212的質(zhì)量控制，觀察結(jié)果。對(duì)所測(cè)得的MIC結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，得出MIC50、MIC90及MIC范圍，測(cè)定結(jié)果按MIC判定標(biāo)準(zhǔn)判定為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果的MIC判定標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍見表1。

表1 糞腸球菌對(duì)12種抗菌藥物藥敏試驗(yàn)的M IC判定標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控范圍mg／L

1.3.4 基因檢測(cè) （1）引物設(shè)計(jì)：在GenBank中查詢腸球菌屬的9種耐藥基因的基因序列（表2），運(yùn)用Primer5.0系列分析軟件設(shè)計(jì)引物。（2）DNA模板制備：采用傳統(tǒng)的煮沸法提取質(zhì)粒DNA［10］，吸取上清作為PCR擴(kuò)增模板。（3）PCR 25μL反應(yīng)體系：其中模板5μL，上、下游引物各0.5μL，dNTP 100 mol／L，其他成分按常規(guī)配比加入后，雙蒸水補(bǔ)至25μL。各種耐藥基因擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s；50℃退火40 s；72℃延伸40 s；循環(huán)35次；72℃再延伸5 m in。其中ermB基因循環(huán)參數(shù)按93℃預(yù)變性2 min，93℃變性30 s；37℃退火90 s；72℃延伸100 s；循環(huán)35次；72℃再延伸10 min。取各個(gè)耐藥基因PCR產(chǎn)物5μL，以2%的瓊脂糖凝膠上100 V電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)檢驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見表3和圖1。

表2 耐藥基因PCR引物系列的設(shè)計(jì)

表3 12種抗菌藥物對(duì)133株糞腸球菌的抗菌活性及糞腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率

圖1 133株糞腸球菌對(duì)12種抗菌藥物的多重耐藥性

133株糞腸球菌對(duì)12種抗菌藥物的耐藥率情況為：耐藥率超過90%的有林可霉素、紅霉素、泰樂菌素和四環(huán)素，超過70%的有氯霉素，超過60%的有?青霉素，超過50%的有鏈霉素、利福平和環(huán)丙沙星，超過40%的有慶大霉素，低于10%的有呋喃妥因和萬古霉素。133糞腸球菌耐藥譜復(fù)雜，所耐的抗菌藥物種類變化大，共得到72個(gè)耐藥譜，多重耐藥性和交叉耐藥性耐藥株以6耐～9耐為主，占81.2%，表現(xiàn)出較為嚴(yán)重的耐藥性。值得注意的是，在4株萬古霉素耐藥糞腸球菌中，有3株表現(xiàn)為對(duì)萬古霉素高度耐藥（MIC＞64 mg／L），且對(duì)鏈霉素和慶大霉素表現(xiàn)為高度耐藥（MIC＞2048 mg／L），高水平慶大霉素（MIC＞500mg／L）和（或）鏈霉素（MIC＞1000mg／L）耐藥檢出比例較高，為大于60%，且兩對(duì)者同時(shí)耐藥的有32株。

2.2 耐藥基因檢測(cè) 結(jié)果見表4。5133株糞腸球菌中，除未檢出mefA和vanB基因外，vanA、aac（6’）／aph（2”）、ant（6）－Ⅰ、aph（3’）－Ⅲ、tetM、ermB和TEM基因的檢出率范圍為3.0%～95.5%，基因陽(yáng)性相對(duì)表型陽(yáng)性的符合率范圍為78.2%～100%。

表4 133株糞腸球菌耐藥基因的檢測(cè)率和符合率

3 討論

從藥敏結(jié)果分析，除對(duì)呋喃妥因和萬古霉素敏感外，對(duì)其余抗菌藥物都呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，且多重耐藥性和交叉耐藥性嚴(yán)重，與相關(guān)報(bào)道一致［1，11－12］。這與近年來隨著腸球菌屬對(duì)抗菌藥物耐藥性的逐漸上升，又出現(xiàn)了耐萬古霉素腸球菌（VRE）和高水平氨基糖苷類耐藥（HLAR）［13－15］，給獸醫(yī)臨床治療帶來了困難情況相一致。

從耐藥基因檢測(cè)結(jié)果分析，本試驗(yàn)133株糞腸球菌中，tetM基因的檢出率為91.0%，基因陽(yáng)性相對(duì)表型陽(yáng)性的符合率為93.8%，說明tetM基因的存在是糞腸球菌分離株對(duì)四環(huán)素耐藥的主要因素。ermB基因的檢出率為95.5%，高于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［1，15］，未檢測(cè)出mefA基因，基因陽(yáng)性相對(duì)表型陽(yáng)性的符合率為96.2%，可見糞腸球菌對(duì)紅霉素耐藥仍以ermB基因的作用機(jī)制為主。有5株紅霉素耐藥糞腸球菌未檢出ermB基因，是否攜帶ermB基因家族其他類型基因?qū)е录t霉素耐藥，還需要進(jìn)一步研究。對(duì)慶大霉素耐藥的64株分離株中aac（6’）／aph（2”）基因的符合率為87.5%，鏈霉素耐藥的68株糞腸球菌中ant（6）－I基因的符合率為89.7%，aph（3’）－Ⅲ基因32株，檢出率為24.1%，雙功能酶基因aac（6’）／aph（2”）和ant（6）－Ⅰ基因的符合率均大于80%，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［16］，說明aac（6’）／aph（2”）和ant（6）－Ⅰ介導(dǎo)了糞腸球菌分離株的高水平氨基糖苷類耐藥（HLAR）。TEM基因的檢出率為63.2%，基因型陽(yáng)性的菌株表型均為陽(yáng)性符合率為78.2%，表明攜帶TEM基因是導(dǎo)致糞腸球菌分離株對(duì)青霉素類耐藥的主要原因。有4株耐萬古霉素的糞腸球菌中檢出vanA基因，未檢測(cè)出vanB基因。

目前，腸球菌屬已是醫(yī)學(xué)臨床感染分離率較高的細(xì)菌，呈多重耐藥，給臨床治療帶來困難。本研究采集豬源糞腸球菌，從耐藥表型和基因水平檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，攜帶耐藥基因是導(dǎo)致糞腸球菌分離株對(duì)相應(yīng)抗生素耐藥的主要因素，因此加強(qiáng)細(xì)菌耐藥基因的檢測(cè)，可為科學(xué)制定抗菌感染的防治方案及細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)提供必要的理論依據(jù)。

［1］ 齊亞銀，張莉，王靜梅，等.動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)7種抗生素耐藥表型及耐藥基因檢測(cè)［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30（7）：962－963.

［2］ 劉燕霏，楊建德，趙瑞利.糞腸球菌動(dòng)物致病的研究進(jìn)展［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，34（11）：75－76.

［3］ 瞿婷婷，陳亞崗，俞云松.腸球菌耐藥性研究［J］.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2004，16（7）：3－5.

［4］ 林榮高.湖南省豬源糞腸球菌基因多樣性分析［D］.湖南長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：7－22.

［5］ 黎滿香.感染豬的糞腸球菌的分離鑒定及部分特性和診斷方法研究［D］.湖南長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010：4－12.

［6］ Donabedian SM，PerriM B，Abdujamilova N，et al.Characterization of vancomycin－resistant Enterococcus faecium isolated from swine in three Michigan counties［J］.JClin Microbiol，2010，48（7）：4156－4160.

［7］ Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twentieth informational supplement［S］.2013：M100－S23.

［8］ Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.Development of in vitro susceptibility testing criteria and quality control parameters for veterinary antimicrobial agents［S］.2008：M37－A3.

［9］ Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）.Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically［S］.2012：M07－A9.

［10］李水法，王華鈞，孫小軍等.腸球菌屬耐藥基因檢測(cè)［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（1）：14.

［11］Oprea SF，Zaidi N，Donabedian SM，et al.Molecular and clinical epidemiology of vancomycin resistant Enterococcus faecalis［J］.JAnti－microb Chemother，2004，53（4）：626－630.

［12］Qu T T，Chen Y G，Yu Y S，et al.Genotypic diversity and epidemiology of high－level gentamicin resistant Enterococcus in a Chinese hospital［J］.J Infect，2006，52（2）：124－130.

［13］劉長(zhǎng)連，徐韞健，梁權(quán)輝.氨基糖苷類高水平耐藥腸球菌耐藥基因的檢測(cè)與研究［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜，2013，25（3）：298.

［14］羅潤(rùn)齊，葉曉光，王若倫.糞腸球菌耐藥譜5年動(dòng)態(tài)觀察與分析［J］.廣州醫(yī)藥雜，2008，39（2）：47－48.

［15］劉晶，朱文君，趙娟.腸球菌多重耐藥性及耐藥基因的研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2011，21（8）：2059.

［16］孟峻，張軍力，郭素芳.耐高濃度慶大霉素腸球菌檢測(cè)及藥敏結(jié)果分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19（19）：2607－2609.

（編輯：李文平）

Analysis of Genotype and Antim icrobial Resistance in Enterococcus faecalis Isolated from Pigs

DONG Dong1，2，SHANG Jun1?，QIAN Xiao－lu1，TIAN Kai1
（1.Shanghai Institute for Veterinary Drug＆Feeds Control，Shanghai 201103，China；2.Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

This study was conducted to investigate the antibiotic susceptibility and resistance genotypes in Enterococcus faecalis strains isolated from ten Large－scale pig farms in Shanghai.133 strains of E.faecalis were collected between March 2013 and May 2014.The susceptibility testingwas performed by brothmicrodilution，and the genotypes ofβ－lactam antibiotics resistance－associated gene（TEM），aminoglycoside genes［aac（6’）／aph（2”），aph（3’）－Ⅲand ant（6）－Ⅰ］，tetracycline gene（tetM），erythromycin genes（ermB and mefA）and vancomycin genes（vanA and vanB）were analyzed by PCR.The positive rate of the resistance genes ermB，tetM，TEM，ant（6）－Ⅰ，aac（6’）／aph2”，aph（3’）－Ⅲ，vanA in the 133 strains of E.faecalis tested were 95.5%（127／133），91.0%（121／133），63.2%（84／133），45.9%（61／133），42.1%（56／133），24.1%（32／133），and 3.0%（4／133），respectively.No mefA and vanB gene strains were detected.12 kinds of antibacterial drug resistance were relatively serious and 6～9 resistance as themain drug resistant strains were detected，accounting for 81.2%.This study shows thatmultidrug resistance of E.faecalis was a serious issue，and resistance genes harbored were the very important reasons for resistance to antibiotics in E.faecalis.

Enterococcus faecalis；antimicrobial resistance；genotype；antimicrobial agents

2014－10－27

A

1002－1280（2015）02－0013－05

S852.61＋1

董棟，碩士研究生，從事動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的研究。

商軍。E－mail：sjshvdc＠163.com