邵清，唐艷，萬玲，孔令聰，裴志花，馬紅霞，2?

（1.吉林農業(yè)大學動物科學科技學院，長春130118；2.動物生產與產品質量安全教育部重點實驗室，長春130118）

家蠅幼蟲溶菌酶II基因的克隆、表達及抑菌活性研究

邵清1，唐艷1，萬玲1，孔令聰1，裴志花1，馬紅霞1，2?

（1.吉林農業(yè)大學動物科學科技學院，長春130118；2.動物生產與產品質量安全教育部重點實驗室，長春130118）

以本實驗室構建的雞致病性大腸桿菌誘導家蠅幼蟲抑制性消減雜交文庫（SSH）為基礎，對家蠅幼蟲溶菌酶II基因（MdL－II）進行克隆，得到全長為532 bp的cDNA片段，其開放閱讀框（ORF）與GenBank中登錄號為HQ897688.1的MdL－II基因全序列同源性為95%。將MdL－IIORF序列插入到pET－32a（＋）表達載體中成功構建重組質粒，其表達產物經十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析，結果顯示約在34 ku處出現表達條帶且與目的蛋白大小相符。當誘導溫度為37℃，IPTG濃度為0.6 mmol／L時可獲得大量可溶性Trx－MdL－II融合蛋白，純化融合蛋白并進一步檢測該蛋白的抑菌活性，結果表明融合蛋白對大腸桿菌和鏈球菌均有抑菌作用，且對大腸桿菌的抑菌作用相對較強。

家蠅幼蟲；家蠅溶菌酶II基因；克隆表達；蛋白純化

溶菌酶作為抗菌肽家族中的一員，在抵抗病原微生物方面發(fā)揮著舉足輕重的作用［1－2］。相關研究表明，溶菌酶基因可在經病原微生物刺激的家蠅幼蟲腸內和脂肪內高效表達［3］，從而殺滅入侵的病原微生物起到保護自身不受傷害的作用，這也是家蠅幼蟲能長期生存在惡劣環(huán)境中而自身不感染病原菌的主要原因之一，其抗菌機理可能是通過消化細菌細胞壁的肽聚糖層水解N－乙酰胞壁酸和N－乙酰氨基葡萄糖之間的β－1，4糖苷鍵來破壞微生物細胞壁使細胞失去保護而裂解凋亡［4］。本研究以雞致病性大腸桿菌誘導三日齡家蠅幼蟲后構建的家蠅幼蟲抑制性消減雜交文庫（SSH）為基礎，對篩選出的差異基因家蠅幼蟲溶菌酶II基因（Musca domestica lysozyme－II，MdL－II）進行克隆表達，并對純化產物進行活性檢測，以期為進一步研究Trx－MdL－II融合蛋白的相關活性及構效關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SSH文庫、受體菌和表達載體 以臨床分離獲得的雞腸道致病性大腸桿菌誘導家蠅3日齡幼蟲后構建的SSH文庫，3’和5’－RACE Ready cDNA由吉林農業(yè)大學獸醫(yī)藥理學實驗室成員完成［5］。感受態(tài)細胞E.coli DH5α、感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3）、原核表達載體pET－32a（＋）均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 SMARTTMRACE cDNA Amplifica?tion，Clontech Laboratories，Inc公司。Ex TaqTMDNA聚合酶、限制性內切酶Xho I、Bam H I、Hin d III、pMD18－T載體試劑盒、DL 2000DNA Marker、λ－Hin d III digest DNA Marker、T4 DNA Ligase，大連寶生物工程有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。異丙硫代β－D半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（AMP），自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。瓊脂糖、DTT（二硫蘇糖醇）、TEMED（四甲基乙二胺）、尿素、Imidazole（咪唑），Sigma公司。His TrapTMFF crude預裝柱，瑞典GE healthcare公司。其余試劑均為國產分析純。

1.1.3 引物合成及DNA測序 引物合成及重組質粒的測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 家蠅幼蟲溶菌酶II基因的cDNA末端快速擴增（RACE） 針對SSH文庫中篩選獲得的MdL－II基因cDNA序列設計特異性引物。利用Primer5.0軟件根據SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書中設計特異性引物的原則設計3’RACE和5’RACE特異性引物如下GSP2：5’－GCACTCATCG?TAGGAGAAGGCACC－3’；GSP1：5’－GGCTCTCGCGAC?TATGGTATCTTCC－3’。將特異性引物送由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴增3’RACE和5’RACE由本實驗室成員獨立完成。RACE擴增產物經回收純化后與pMD18－T載體連接，連接產物轉化入E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，將酶切驗證為陽性的重組質粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。

1.2.2 MdL－II基因開放閱讀框的擴增 將測序成功后得到的5’和3’末端序列利用DNAMAN軟件拼接獲得MdL－II基因的全長cDNA序列。運用在線網站http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html尋找該序列的ORF序列。利用Primer5.0軟件對該ORF序列設計特異性引物MdL－IIF和MdL－IIR如下：MdL－IIF，5’－TAGGATCC ATGTTCAAATTCACC－3’（含Bam H I酶切位點）；MdL－IIR，5’－CACTC?GAGTTAGAAGCAATCATCA－3’（含XhoⅠ酶切位點）。

以家蠅幼蟲5’－RACE－Ready cDNA為模板對MdL－II基因ORF序列進行PCR擴增，回收PCR產物并純化后與pMD18－T載體連接，連接產物轉化入E.coli DH5α感受態(tài)細胞中。提取質粒經雙酶切驗證為陽性后，將重組質粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。將該重組質粒命名為pMD18－T－MdL－II。

1.2.3 MdL－II基因ORF序列的測定及序列同源性分析 運用NCBI網站http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi對MdL－II基因ORF序列進行BLASTN分析。運用DNAMAN軟件分析MdL－II基因ORF序列與已知溶菌酶基因序列的同源性。

1.2.4 MdL－II基因原核表達質粒的構建 將原核表達載體質粒pET－32a（＋）與重組質粒pMD18－TMdL－II進行Bam H I和Xho I雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后回收MdL－II目的基因和pET－32a（＋）原核表達載體。將MdL－II目的基因與pET－32a（＋）原核表達載體連接過夜，次日將連接產物轉化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，提取重組質粒并進行雙酶切鑒定，將獲得的陽性重組質粒送由生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。將重組質粒命名為pET－32a－MdL－II。

1.2.5 重組質粒pET－32a－MdL－II表達產物的SDS－PAGE分析 將測序成功的重組陽性質粒pET－32a－MdL－II轉化到E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，參照文獻［6］的方法挑取單克隆菌落接種于含5μLAmp的5 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃150 r／min振蕩培養(yǎng)過夜后取3 mL菌液接種于300 mL液體LB培養(yǎng)基中，監(jiān)測菌液OD600值在0.6～0.8之間時，加入IPTG進行誘導表達。誘導表達的菌液經TE反復吹洗2次后，冰浴超聲波破碎，分別取上清和沉淀進行SDS－PAGE電泳分析。

1.2.6 重組質粒pET－32a－MdL－II表達條件的優(yōu)化挑取含有重組質粒pET－32a－MdL－II的單克隆菌落進行培養(yǎng)，檢測目的基因在誘導劑（IPTG）濃度和誘導溫度不同時表達水平的變化。參照文獻［6］的方法針對起始濃度（OD600為0.7）、誘導時間（6 h）和誘導溫度（37℃）相同的菌液變化IPTG終濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol／L觀察其表達水平的變化；對起始濃度（OD600為0.7）、誘導時間（6 h）和IPTG終濃度（0.6 mmol／L）相同的菌液變化誘導溫度10、20、28、37℃觀察其表達水平的變化。對上述試驗菌液各取1mL進行SDS－PAGE電泳，分析目的蛋白的表達量從而確定重組質粒pET－32a－MdL－II的最佳表達條件。

1.2.7 Trx－MdL－II融合蛋白的親和純化 收集最優(yōu)誘導條件下表達的菌液，以TE（pH 8.0）緩沖液反復洗滌菌體2次，冰浴超聲波破碎菌體后，4℃12000 r／min離心30 min。取超生破碎后的上清液進行親和純化，操作過程參照GE healthcare的His TrapTMHP說明書進行。

1.2.8 Trx－MdL－II融合蛋白抑菌活性檢測 用超濾管將純化獲得的融合蛋白進行濃縮，采用牛津杯法檢測融合蛋白的抑菌活性［7］。取100μL菌液（105CFU／mL）均勻涂布于LB平板上，放入牛津杯，杯內加入100μLTrx－MdL－II融合蛋白，37℃培養(yǎng)12 h，觀察有無抑菌環(huán)出現，并測量抑菌環(huán)大小。

2 結果

2.1 MdL－II基因的cDNA末端快速擴增 用MdL－II基因的特異性引物進行PCR擴增（圖1），將3’與5’擴增產物分別與pMD18－T克隆載體連接，提質粒經雙酶切（Xho I，Hin d III）驗證為陽性后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析，獲得一條411 bp的3’端片段（圖2），獲得一條362 bp的5’端片段（圖3），利用DNA軟件進行拼接得到大小為532 bp的全長序列。

圖1 MdL－II基因的RACE擴增結果

圖2 MdL－II基因3’重組質粒酶切鑒定結果

圖3 MdL－II基因5’重組質粒酶切鑒定結果

2.2 全長基因的PCR擴增 用MdL－II基因的全長引物進行PCR擴增得到一條約為429 bp的片段（圖4）。pMD18－T－MdL－II重組質粒雙酶切驗證顯示，獲得的條帶與429 bp大小相符（圖5），證明克隆載體重組質粒構建成功。

圖4 MdL－II全長基因的擴增結果

圖5 pMD18－T－M dL－II重組質粒的雙酶切驗證

2.3 MdL－II基因ORF序列的測定及序列同源性分析 MdL－II基因ORF片段長度為429 bp，運用NCBI網站對MdL－II全長基因序列進行BLAST比對分析，結果顯示MdL－II基因與Genbank中登錄號為HQ897688.1的家蠅溶菌酶II基因全序列同源性為95%，氨基酸序列同源性為97%，且差異氨基酸散在分布于氨基酸序列當中。此外，MdL－II基因與登錄號為AY344588.1的家蠅富含賴氨酸的溶菌酶2基因序列同源性為93%，與登錄號為AY344589.1的家蠅溶菌酶1基因序列同源性為74%。

2.4 pET－32a－MdL－II重組質粒的構建 pET－32a－

MdL－II重組質粒經雙酶切驗證后，獲得大小約為429 bp和5900 bp的片段（圖6），分別為MdL－II全長基因目的片段和pET－32a（＋）表達載體，表明pET－32a－MdL－II原核表達重組質粒構建成功。

2.5 MdL－II基因表達產物的SDS－PAGE分析分別誘導帶有pET－32a（＋）空載體質粒的E.coli BL21（DE3）菌液和帶有pET－32a－MdL－II重組質粒的E.coli BL21（DE3）菌液表達，取誘導后的表達產物進行SDS－PAGE分析。結果顯示，經誘導的重組菌液在約34 ku大小處出現表達條帶，與預期表達蛋白大小相符（圖7）。對重組菌進行冰浴超聲破碎，電泳檢測發(fā)現目的蛋白大部分存在于上清液中，在沉淀中含量較少，屬于可溶性表達（圖8）。

圖6 pET－32a－MdL－II重組質粒酶切鑒定

圖7 重組質粒表達產物PAGE電泳

圖8 融合蛋白在上清和沉淀中表達量的對比

2.6 重組質粒pET－32a－MdL－II表達條件的優(yōu)化分別采用不同濃度的IPTG進行誘導，各取1 mL誘導菌液進行SDS－PAGE電泳分析（圖9），結果表明當IPTG濃度為0.6 mmol／L時融合蛋白獲得高效表達。在IPTG濃度為0.6 mmol／L條件下，分別采用10、20、28、37℃進行誘導，各取1 mL誘導菌液進行SDS－PAGE電泳分析（圖10），結果顯示當誘導溫度為37℃時融合蛋白表達量較大。

2.7 Trx－MdL－II融合蛋白的純化 采用鎳離子親和層析方法純化經超聲破碎后含有目的蛋白的上清液。SDS－PAGE結果顯示，140 mM的咪唑洗脫液中含有分子量約為34 ku的融合蛋白目的條帶（圖11）。

2.8 Trx－MdL－II融合蛋白的抑菌活性檢測 大量收集純化后的融合蛋白并以超濾管濃縮后得到濃度為2.312 mg／mL的融合蛋白。以洗脫液為對照與濃縮后的融合蛋白進行抑菌效果的比較（圖12－圖13）。

圖9 不同濃度IPTG誘導下融合蛋白表達量分析

圖10 不同誘導溫度下融合蛋白表達量分析

圖11 Trx－MdL－II融合蛋白的純化產物

圖12 融合蛋白對鏈球菌的抑菌實驗

濃縮后的融合蛋白對鏈球菌和大腸桿菌均有抑菌環(huán)出現，融合蛋白對鏈球菌的抑菌環(huán)直徑為7 mm，對大腸桿菌的抑菌環(huán)直徑為16 mm，而洗脫液沒有抑菌環(huán)出現，說明融合蛋白對鏈球菌和大腸桿菌均有抑菌作用。

3 討論

在微生物的誘導刺激下家蠅可通過部分基因的選擇性表達對自身免疫反應進行調控，以合成的一系列免疫活性物質對異物的侵襲進行抵御［8］。相關研究表明與家蠅免疫防御功能相關的基因包括：防御素基因、攻擊素基因、天蠶素基因、溶菌酶基因、肽聚糖識別蛋白基因、金屬硫蛋白基因、熱休克蛋白70基因等［9－10］，這些基因均與家蠅免疫反應休戚相關。近年來，隨著人們對家蠅免疫基因進行深入研究，溶菌酶做為抗菌肽的主要成員已逐步受到了人們的高度重視。

研究人員在對溶菌酶的進一步研究中發(fā)現不同來源的溶菌酶抑菌活性各不相同，并且具有較廣的抗菌譜。相關研究報道重組海參溶菌酶C端基因（SjLys－C）的表達產物對溶壁微球菌和副溶血弧菌有較高的抑菌活性［11］。趙燕靜等［12］發(fā)現天然三倍體淇河鯽不同組織器官中的溶菌酶抑菌活性存在差異，對霍亂弧菌的抑制作用最強的為肝胰臟和腎臟中的溶菌酶。宋佳［13］以3種微生物（大腸桿菌、蛹蟲草菌及柞蠶微孢子蟲）誘導柞蠶蛹后，研究免疫血淋巴的抑菌作用結果顯示3個處理組的柞蠶踴血淋巴中提取的溶菌酶對溶壁微球菌所產生的抑菌圈直徑均在14－22 mm之間。王梅梅等［14］成功構建了pET－32a－MdL－1原核表達載體，并對其融合蛋白的生物學活性進行鑒定，結果顯示溶菌酶融合蛋白對雞致病性大腸桿菌有抑菌活性。

本試驗對MdL－II差異基因進行了克隆表達，該基因與王梅梅等克隆的家蠅溶菌酶1基因序列同源性為68%，氨基酸序列同源性為73%，為進一步研究MdL－II差異基因的生物學活性，本實驗構建了pET－32a（＋）－MdL－II表達載體，探索了不同濃度IPTG對Trx－MdL－II融合蛋白表達量的影響，進而對融合蛋白的體外抑菌活性進行了檢測。結果表明，選用濃度為0.6 mmol／L的IPTG時融合蛋白表達量較高并多以可溶蛋白的形式存在于裂解液上清中；融合蛋白對大腸桿菌和鏈球菌均有抑菌作用，且對大腸桿菌的抑菌活性明顯高于家蠅溶菌酶1基因的表達產物，因此，Trx－MdL－II融合蛋白在農業(yè)和醫(yī)藥等行業(yè)中具有潛在應用和開發(fā)價值。

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（編輯：陳希）

Cloning and Prokaryotic Expression of the Lysozyme IIGene from Musca domestica Larvae

SHAO Qing1，TANG Yan1，WAN Ling1，KONG Ling－cong1，PEIZhi－h(huán)ua1，MA Hong－xia1，2?
（1.College of AnimalScience and Technology，Jilin Agriculural University，Changchun 130118，China；2.Animal Production＆Product Quality and Security，Ministry ofEducation，Changchun 130118，China）

The experiment was based on the suppression subtractive hybridization library（SSH）induced by Pathogenic Escherichia coli of chicken which constructed by Animal Pharmacology and Toxicology Laboratory.Amplify Md－lysozyme IIgene’sfull－length cDNA，then sequencing analysis showed that the full－length cDNA of Md－lysozyme II gene was 532 bp，in size，the homology of the open reading frame cDNA sequence with the Md－lysozyme II（HQ897688.1）from GenBank is up to 95%.The Md－lysozyme IIgene was ligated into expression vector pET－32a（＋）.The recombinant protein was verified by SDS－PAGE，the results showed that the recombinant protein was about 34 ku and consistent with the size of the target protein.When the induction temperature was 37℃and the concentration of IPTG was 0.6 mmol／L we could get a large amount of soluble Trx－MdL－IIrecombinant protein..In order to obtain high purity recombinant protein we used nickel ion affinity chromatography to purify Trx－MdL－II recombinant protein.While the recombinant protein could inhibit the growth of Escherichia coli and Streptococcus，the inhibitory effect on Escherichia coli was relatively stronger than on Streptococcus.Key words：Musca domestica larvae；Md－lysozyme II；cloning and expression；protein purification

2014－11－25

A

1002－1280（2015）02－0001－06

S852.6

教育部新世紀優(yōu)秀人才項目（NCET－10－0174）；吉林省世行貸款農產品質量安全項目（2011－Y05）；吉林省科技廳項目（20111820）

邵清，碩士研究生，從事動物藥理與毒理學方面研究。

馬紅霞。E－mail：hongxia0731001＠163.com