李永金，楊開勇，張 誼，陳月芳，端禮榮，黃曉佳

(江蘇大學醫(yī)學院 1.藥理學系、2.基礎醫(yī)學與預防醫(yī)學實驗中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

低氧誘導因子-1α在喹啉酸誘導的PC12細胞損傷中的作用

李永金1，楊開勇1，張 誼1，陳月芳2，端禮榮2，黃曉佳1

(江蘇大學醫(yī)學院 1.藥理學系、2.基礎醫(yī)學與預防醫(yī)學實驗中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

目的 探討低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在喹啉酸誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞損傷中的作用。方法 用不同濃度的喹啉酸(2.5，5和10 mmol·L-1)處理PC12細胞24 h誘導細胞損傷，采用噻唑藍還原法和乳酸脫氫酶漏出率檢測法測定細胞損傷程度，采用丙二醛和超氧化物歧化酶試劑盒檢測細胞內(nèi)氧自由基水平，Hoechst 33258單熒光染色法觀察細胞凋亡，免疫熒光染色法檢測HIF-1α在細胞內(nèi)的表達，免疫印跡法檢測細胞HIF-1α、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(phosphorylated-Akt，p-Akt)、淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)和 Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)的表達。結(jié)果 喹啉酸可劑量依賴性地誘導PC12細胞損傷，導致細胞內(nèi)氧自由基增多和細胞凋亡。同時，喹啉酸可使PC12細胞HIF-1α表達上調(diào)并聚集于核內(nèi)；p-Akt表達增加，Bax/Bcl-2表達比例增加。結(jié)論 HIF-1α和Akt介導了喹啉酸誘導PC12的細胞凋亡；此外，氧化應激過程也可能參與了細胞損傷。

喹啉酸；PC12細胞；細胞損傷；細胞凋亡；HIF-1α；信號通路；氧化應激

許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦缺血、阿爾茨海默病、帕金森病等的發(fā)生、發(fā)展過程，均與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸，毒性損傷有關(guān)。喹啉酸(quinolinic acid，QA)是一種內(nèi)源性谷氨酸受體亞型N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受體激動劑，可誘導神經(jīng)細胞損傷；其在大腦中含量大量增加是引起神經(jīng)元損傷的一個重要原因[1]，因此被廣泛用于制作神經(jīng)細胞損傷模型。

在神經(jīng)元損傷過程中，有多種因子參與了細胞的死亡過程，其中低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)受到了廣泛的關(guān)注。HIF-1廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi)，是目前發(fā)現(xiàn)的一種能感受細胞氧分壓的調(diào)控蛋白。HIF-1由氧敏感的HIF-1α和組成性表達的HIF-1β兩個亞基組成，其中HIF-1α是主要的活性亞基[2]。在常氧下，細胞HIF-1α通過泛素-蛋白酶系統(tǒng)被迅速降解，在胞質(zhì)中幾乎檢測不到；在低氧下，HIF-1α變得穩(wěn)定，繼而通過其核定位信號轉(zhuǎn)移至細胞核，與HIF-1β結(jié)合形成異二聚體HIF-1[2-3]。HIF-1通過作用于靶基因上的低氧反應元件調(diào)控基因的表達，參與血管形成、糖代謝、細胞存活和增殖等過程[2-3]。在缺血性或出血性腦損傷后，大鼠腦組織HIF-1α表達明顯提高[4-5]；而離體培養(yǎng)的細胞經(jīng)缺氧缺糖處理后，HIF-1α表達也明顯提高，且出現(xiàn)細胞核內(nèi)聚集[6]，表明HIF-1調(diào)節(jié)了神經(jīng)細胞的損傷過程。但HIF-1α是否調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞興奮性損傷，其作用的分子機制目前仍不明確。

本實驗選用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞作為實驗對象，以不同濃度QA進行損傷，以模擬神經(jīng)細胞興奮性毒性損傷，探討HIF-1α在PC12細胞損傷過程中的作用及其信號通路，為證實HIF-1α及其信號通路參與神經(jīng)元興奮性損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株來自于中國科學院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。QA購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)檢測試劑盒均均購自蘇州科銘生物公司。噻唑藍(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)購自美國Amresco公司；Hoechst 33258購自美國Sigma公司。兔抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗HIF-1α、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(bcl-2 associated X protein，Bax)多克隆抗體均購自美國ImmunoWay公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體購自上?？党巧镉邢薰?；辣根過氧化物酶或熒光基團標記的二抗均購自北京康為世紀公司；底物化學發(fā)光試劑購自美國Millipore公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理將PC12細胞用含10%新生牛血清、1×105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于含5%CO2和95%空氣的37℃培養(yǎng)箱中，每2 d換液1次，4 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

將PC12細胞以5×104mL-1密度接種于96孔或24孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的QA(終濃度分別為2.5、5、10 mmol·L- 1)處理24 h。對照組細胞中加入相同體積PBS。

1.3 細胞存活率檢測以MTT還原法檢測細胞存活率。藥物處理結(jié)束后，培養(yǎng)板每孔中加入MTT(終濃度為0.5 g·L-1)，37℃反應4 h，吸去上清后每孔加入100 μL二甲基亞砜，振蕩5 min，置酶標儀上于490 nm處測定各孔吸光度值。

此外，以細胞LDH漏出率檢測法檢測細胞死亡率，按照LDH試劑盒說明書進行操作并計算各組胞內(nèi)LDH的含量。

1.4 細胞內(nèi)氧自由基含量檢測實驗分組同上，按照SOD和MDA檢測試劑盒說明書進行操作，計算各組的胞內(nèi)SOD和MDA含量。

1.5 細胞形態(tài)學檢測在PC12細胞經(jīng)不同濃度QA處理后，于普通光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照，觀察細胞形態(tài)變化。

工科院校教師專業(yè)化發(fā)展思想的缺失，直接給新教師培訓帶來三大“災難”：學校領導不重視，職能部門不積極，二級教學單位不主動；新教師培訓過程形式化、表面化，違背“教學知識、教學技能、教學能力”逐層遞進發(fā)展規(guī)律；新教師培訓評價的“教學性”弱化，培訓效果不理想，培訓目標達成度低。

1.6 細胞凋亡檢測將PC12細胞接種于玻璃片上，經(jīng)藥物處理后棄去培養(yǎng)液，經(jīng)PBS洗滌后，用冰甲醇固定細胞10 min。吸去固定液，用PBS洗滌后加入Hoechst 33258 染色液(終濃度為10 mg·L-1)于室溫下反應5 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核皺縮，熒光亮度增加。

1.7 細胞內(nèi)HIF-1α的表達定位檢測將PC12細胞接種于玻璃片上，經(jīng)藥物處理后固定細胞，以0.3% Triton X-100透化10 min，羊血清封閉30 min后，滴加抗HIF-1α抗體(1 ∶300)，4℃反應過夜；PBS洗滌后加入Cy3標記的二抗(1 ∶600)室溫下避光反應1 h，加入Hoechst 33258染色液室溫下反應5 min染細胞核，用50%甘油封片，置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 細胞HIF-1α、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白的表達檢測細胞經(jīng)不同濃度QA處理后，收集細胞，提取總蛋白并測定蛋白濃度。將30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜并封閉后，加入抗HIF-1α(1 ∶1 000)、Akt(1 ∶1 000)、p-Akt(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶7 000)抗體于4℃反應過夜。洗滌后，將膜和相應二抗(1 ∶5 000)在室溫下反應1 h，以底物化學發(fā)光試劑顯色后并以凝膠成像系統(tǒng)(ChampGel 5000，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)進行掃描，以Image J軟件分析各條帶灰度值。以GAPDH條帶灰度值作參照，進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度QA對PC12細胞存活率的作用MTT還原法檢測實驗結(jié)果表明，如Fig 1A所示，PC12細胞經(jīng)不同濃度QA(2.5～10 mmol·L-1)處理24 h，細胞存活率逐漸降低，2.5 mmol·L-1QA即可引起細胞出現(xiàn)明顯損傷。經(jīng)計算，QA引起PC12細胞損傷的50%抑制濃度(IC50)為8.7 mmol·L-1。此外，如Fig 1B所示，LDH漏出率實驗結(jié)果也表明，QA(2.5～10 mmol·L-1)可劑量依賴性地引起PC12細胞損傷。

2.2 不同濃度QA損傷后PC12細胞內(nèi)SOD和MDA水平變化機體在正常狀態(tài)下存在氧化與抗氧化的平衡體系，內(nèi)源性抗氧化酶如SOD可清除氧自由基，保護細胞免受損傷[7]。當機體抗氧化體系能力減弱時，過量氧自由基可攻擊生物膜而引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，導致過氧化產(chǎn)物如MDA大量產(chǎn)生[8]，因而SOD活性降低和MDA含量增加均提示氧自由基水平的增加，亦可間接反映了細胞損傷的程度。在本實驗中，采用SOD和MDA檢測法評價細胞內(nèi)氧自由基水平。如Fig 2所示，PC12細胞經(jīng)不同濃度QA(2.5～10 mmol·L-1)處理24 h后，隨著QA的濃度增大，細胞內(nèi)SOD含量明顯下降，而MDA的含量明顯增加。

2.3 不同濃度QA對PC12細胞的形態(tài)影響如Fig 3所示，對照組PC12細胞形態(tài)完整，胞體飽滿，立體感強，周圍有光暈，突起明顯。經(jīng)5 mmol·L-1QA損傷24 h后，PC12細胞突起明顯減少并出現(xiàn)死亡；而10 mmol·L-1QA可引起細胞透光率下降，胞體明顯皺縮，軸突變短變少，并導致大量細胞死亡。2.5 mmol·L-1QA對PC12細胞形態(tài)無明顯作用。

2.4 不同濃度QA對PC12細胞凋亡的影響熒光染料Hoechst 33258能少許透過正常細胞膜，使正常細胞產(chǎn)生低強度藍色熒光；而凋亡細胞由于膜通透性增強，進入細胞內(nèi)的染料比正常細胞多，故熒光強度明顯增加。如Fig 4所示，經(jīng)不同濃度QA(2.5～10 mmol·L-1)處理24 h后，對照組細胞核呈現(xiàn)均勻彌散熒光，5 mmol·L-1QA可導致細胞呈現(xiàn)細胞核濃縮碎裂，出現(xiàn)凋亡小體；10 mmol·L-1QA則可導致大量細胞出現(xiàn)凋亡。

Fig 1 Treatment with QA decreased viability in PC12 cells ±s, n=5)

After the treatment with QA for 24 h, the viability of PC12 cells was significantly decreased.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 2 QA increased intracellular levels of SOD and MDA in PC12 ±s, n=5)

After the challenge with QA for 24 h, the intracellular SOD levels were decreased and the MDA levels were increased.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 3 QA decreased number of cellular process and cell viability in PC12 cells

Morphological analysis showed that PC12 cells exhibited decreased the number of cellular process and cell viability after the treatment with QA for 24 h. Scale Bar = 50 μm.

2.5 不同濃度QA對PC12細胞HIF-1α表達定位的影響在細胞處于不同狀態(tài)下，HIF-1α的表達位置和表達量也出現(xiàn)變化，進而導致其功能的變化。本實驗采用熒光免疫組化實驗檢測HIF-1α在細胞內(nèi)的表達定位。如Fig 5所示，在對照組細胞中，HIF-1α幾乎不表達；2.5 mmol·L-1QA處理24 h后，PC12細胞HIF-1α出現(xiàn)低表達；5 mmol·L-1QA則可明顯誘導細胞核內(nèi)HIF-1α聚集；而10 mmol·L-1QA處理使細胞核內(nèi)HIF-1α表達明顯提高。

Fig 4 QA enhanced cell apoptosis in PC12 cells

After the treatment with QA for 24 h, PC12 cells underwent cell apoptosis. Scale Bar = 50 μm.

Fig 5 QA induced nucleic accumulation of HIF-1α in PC12 cells

PC12 cells exhibited nucleic HIF-1α accumulation after the treatment with QA for 24 h. Scale Bar = 20 μm.

2.6 不同濃度QA對PC12細胞HIF-1α、p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達的作用在細胞出現(xiàn)損傷過程中，Akt發(fā)揮了重要作用，其被激活(磷酸化)后會啟動細胞凋亡途徑，造成細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2表達比例出現(xiàn)增高，進而導致細胞凋亡。本實驗中，通過Western blot方法檢測HIF-1α、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白質(zhì)的表達變化。如Fig 6所示，經(jīng)不同濃度QA(2.5～10 mmol·L-1)處理24 h后，PC12細胞p-Akt表達明顯增加，而Akt表達無明顯變化。同時，QA(2.5～10 mmol·L-1)可引起B(yǎng)ax和Bcl-2表達出現(xiàn)變化，導致Bax/Bcl-2表達比值明顯增加。

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，QA(2.5～10 mmol·L-1)可劑量依賴性地引起大鼠PC12細胞損傷，導致細胞內(nèi)氧自由基水平升高，出現(xiàn)凋亡。此外，QA也誘導了PC12細胞HIF-1α高表達和細胞核聚集、Akt磷酸化、Bax/Bcl-2表達比例上調(diào)。這些結(jié)果表明，QA可通過激活HIF-1α及Akt，進而啟動細胞凋亡程序，導致PC12細胞發(fā)生凋亡。

Fig 6 QA increased expressions of HIF-1α,p-Akt

After the challenge with QA in PC12 cells for 24 h, the expressions of HIF-1α,Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax were analyzed by immunoblotting. QA induced the expressions of HIF-1α, p-Akt and increased the relative expression of Bax/Bcl-2.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

興奮性神經(jīng)毒性是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的共同基礎，其中谷氨酸受體所介導的興奮性毒性尤其重要。QA可持續(xù)激動神經(jīng)元膜上NMDA受體，導致鈣離子內(nèi)流使細胞鈣超載，引起細胞損傷[9]；又可刺激抑制星形膠質(zhì)細胞對谷氨酸的再攝取，加重神經(jīng)損傷[10, 11]。同時，QA也可引起活性氧大量釋放，導致神經(jīng)組織氧化損傷，如QA可引起大鼠腦組織大量產(chǎn)生活性氧，導致脂質(zhì)過氧化損傷；而NMDA受體拮抗劑MK-801可減少活性氧產(chǎn)生，起到神經(jīng)保護作用[12-13]。本實驗中，不同濃度QA作用24 h可明顯引起PC12細胞存活率減低，LDH漏出增加，突起減少，胞體變圓。此外，QA可引起細胞SOD和MDA水平變化，提示細胞損傷可能與細胞內(nèi)氧自由基水平增加有關(guān)。

此外，在神經(jīng)細胞損傷過程中，HIF-1α及其信號通路發(fā)揮了重要作用。離體培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元經(jīng)缺血樣損傷后，HIF-1α表達明顯增加，并集中于核內(nèi)，過表達HIF-1α可導致細胞死亡[14]。動物經(jīng)受各種腦損傷如缺血性損傷、撞擊性腦外傷后，腦組織HIF-1α表達上調(diào)，HIF-1α抑制劑如2-甲氧雌甾二醇則具有明顯的保護作用[14-15]，表明HIF-1α可能參與了神經(jīng)損傷。但另一些證據(jù)卻表明HIF-1α參與了神經(jīng)細胞對損傷的適應過程，與野生型小鼠相比，神經(jīng)元特異性HIF-1α基因敲除小鼠對缺氧更加敏感，神經(jīng)細胞損傷更為嚴重[16]；HIF-1α抑制劑可減弱低氧預處理引起的星形膠質(zhì)細胞對氧化損傷的適應作用[17]。這些不一致的實驗結(jié)果提示在神經(jīng)細胞損傷過程中，HIF-1α可能具有雙向適應性調(diào)節(jié)作用：HIF-1α輕度或中度誘導表達可促進細胞適應損傷，而過量表達則導致細胞死亡[18-19]。本實驗結(jié)果表明，5～10 mmol·L-1QA作用24 h可明顯誘導PC12細胞HIF-1α表達，且呈現(xiàn)劑量依賴性，表明HIF-1α信號通路可能參與了PC12細胞損傷過程。同時，HIF-1α的活化受到多種分子的調(diào)控，如活性氧可通過激活一些細胞內(nèi)信號，繼而磷酸化HIF-1α的641和643位的絲氨酸位點，使其穩(wěn)定停留于細胞核內(nèi)發(fā)揮其促基因轉(zhuǎn)錄的作用[20-21]；Akt也可通過調(diào)節(jié)其下游分子如叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O4(forkhead transcription factor O4，F(xiàn)OXO4)、糖原合成酶3β(the glycogen synthase kinase 3 β，GSK3β)等導致HIF-1α的穩(wěn)定[22-23]。本實驗結(jié)果表明，QA可引起PC12細胞內(nèi)活性氧水平升高和Akt的活化，進而導致HIF-1α表達上調(diào)，提示ROS/Akt/HIF-1α可能參與了細胞的損傷過程。

熒光染色實驗結(jié)果證實，PC12細胞損傷后表現(xiàn)出體積縮小，細胞核皺縮等典型凋亡表現(xiàn)，表明QA可誘導細胞出現(xiàn)了凋亡性死亡。細胞凋亡是一種復雜的生化過程，有許多蛋白質(zhì)參與了這一過程，包括Bax和Bcl-2。Bax是一種凋亡前體蛋白，可刺激細胞色素C釋放和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)的激活，誘導細胞發(fā)生凋亡；而Bcl-2可抑制細胞色素C的釋放，是一種抗凋亡蛋白[24-25]。細胞Bax表達增加或Bcl-2表達減低均提示細胞進入凋亡狀態(tài)，Bax/Bcl-2比值是一種重要的凋亡生化指標[26]。已有研究表明，HIF-1α的上調(diào)也可引起B(yǎng)ax/Bcl-2比值上升，進而發(fā)生細胞凋亡[27]；抑制HIF-1α的表達則可減少Bax/Bcl-2比值[28]。與以上結(jié)果相一致，本實驗中PC12細胞經(jīng)QA處理后HIF-1α表達上調(diào)，Bax/Bcl-2表達比值增加，確認QA可通過穩(wěn)定HIF-1α表達，繼而上調(diào)Bax/Bcl-2表達比例。

綜上所述，本研究以大鼠PC12細胞作為實驗對象，證明QA可劑量性導致細胞出現(xiàn)凋亡，同時誘導HIF-1α高表達，Akt磷酸化，表明Akt/HIF-1α信號通路可能參與了該損傷過程。該結(jié)果提示，HIF-1α參與了神經(jīng)興奮毒性，抑制HIF-1α及其下游信號通路可能具有抑制興奮性神經(jīng)細胞損傷的作用。此外，QA也可能通過上調(diào)細胞內(nèi)氧自由基水平引起了HIF-1α的活化，其可能分子機制將會在下一步的實驗中得到研究。

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Role of HIF-1α in quinolinic acid-induced injury in PC12 cells

LI Yong-jin1, YANG Kai-yong1, ZHANG Yi1, CHEN Yue-fang2, DUAN Li-rong2, HUANG Xiao-jia1

(1.DeptofPharmacology,SchoolofMedicine,Jiangsu212013,China;2.ExperimentalCenterofBasicandPreventiveMedicine,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013,China)

Aim To investigate the role of HIF-1α in PC12 cell injury induced by quinolinic acid. Methods PC12 cells were treated with quinolinic acid at the doses of 2.5, 5 and 10 mmol·L-1, the cell viability was determined by MTT reduction assay and LDH assay, the intracellular levels of oxygen species was measured by assessing SOD and MDA levels, cell apoptosis was determined by Hoechst 33258 staining, the intracellular distribution of HIF-1α was examined by HIF-1α immunostaining, and the expressions of HIF-1α,Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax were determined by immunoblotting analysis. Results Quinolinic acid induced cell injury in PC12 cells in a dose-dependent manner, and potentiated oxygen radical production and cell apoptosis. In addition, quinolinic acid enhanced HIF-1α expression and accumulation in nuclei. The p-Akt expression and Bax/Bcl-2 ratio was increased by quinolinc acid in PC12 cells. Conclusions HIF-1α and Akt mediate qunolinc acid-induced cell apoptosis in PC12 cells. And cellular oxidative stress may contribute to the injury as well.

quinolinic acid; PC12 cells; cell injury; cell apoptosis; HIF-1α; signaling pathway; oxidative stress

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.019.html

2014-11-17,

2015-01-08

國家自然科學基金資助項目(No 81300059)；江蘇大學高級人才基金項目(No 08JDG005，11JDG092)

李永金(1968-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向:神經(jīng)藥理學,E-mail: lyj3600@163.com; 黃曉佳(1980-)，男，博士，副教授，研究方向:神經(jīng)藥理學,通訊作者，Tel: 0511- 88791201，E-mail：harold1980@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.011

A

1001-1978(2015)04-0493-07

R-332；R329.25；R338.1；R977.6