夏小慧， 夏惠蕓， 郭 潔， 劉康超， 胡 揚

(1. 蘭州城市學(xué)院， 2. 國營長風(fēng)機器廠職工醫(yī)院， 甘肅 蘭州 730070； 3. 北京體育大學(xué)， 北京 100084)

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HSL基因重復(fù)多態(tài)與有氧耐力的關(guān)聯(lián)性*

夏小慧1， 夏惠蕓2， 郭 潔1， 劉康超1， 胡 揚3△

(1. 蘭州城市學(xué)院， 2. 國營長風(fēng)機器廠職工醫(yī)院， 甘肅 蘭州 730070； 3. 北京體育大學(xué)， 北京 100084)

目的：探討激素敏感性脂肪酶(HSL)基因重復(fù)多態(tài)與有氧耐力之間的關(guān)聯(lián)性。方法：采用PCR結(jié)合熒光標(biāo)記復(fù)合STR-genescan方法，對123名中國北方漢族優(yōu)秀長跑運動員與127名中國北方漢族普通大學(xué)生HSL基因第6內(nèi)含子區(qū)(CA)n 重復(fù)多態(tài)基因分型進(jìn)行檢測，對重復(fù)多態(tài)按分割點進(jìn)行分組，劃分為長、短鏈兩個等位基因，卡方檢驗比較運動員組和對照組間等位基因頻率和基因型頻率差別。結(jié)果：HSL基因(CA)n重復(fù)多態(tài)共有9種不同重復(fù)次數(shù)的等位基因，組成25種不同基因型?？ǚ綑z驗結(jié)果顯示，當(dāng)以4重復(fù)次數(shù)為分割點劃分短鏈和長鏈等位基因進(jìn)行比較時，基因型的分布在5/10 km組與對照組相比，有顯著性差異(P<0.05)。其余各組間進(jìn)行比較，均無顯著性差異。結(jié)論：HSL基因第6內(nèi)含子(CA)n重復(fù)多態(tài)，當(dāng)以4重復(fù)次數(shù)為分割點劃分短鏈和長鏈等位基因進(jìn)行比較時，LL基因型與有氧耐力相關(guān)聯(lián)，可能是5/10 km運動員的分子標(biāo)記。

HSL；基因多態(tài)性；有氧耐力；分子標(biāo)記

在人體的能源系統(tǒng)中，與糖儲備相比，內(nèi)源脂肪是一種相對無限的能源。而激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase,HSL)，是脂肪分解的限速酶[1]，能水解甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯等，產(chǎn)生脂肪酸。脂肪動員和脂肪利用能力的提高，對改善運動能力，尤其是耐力運動水平有著重要的作用[2,3]。

有氧耐力是一項遺傳度較高的運動能力。近年來，大量研究通過對與有氧耐力相關(guān)的基因多態(tài)位點的研究，篩選出了多個與有氧耐力運動能力相關(guān)聯(lián)的遺傳學(xué)分子標(biāo)記[4-6]，研究結(jié)果為將來依據(jù)遺傳學(xué)標(biāo)記進(jìn)行優(yōu)秀有氧耐力運動員的基因選材提供了依據(jù)。HSL基因是通過調(diào)節(jié)脂肪動員，從而影響有氧耐力表型的微效基因，其基因多態(tài)位點可能是影響有氧耐力的遺傳學(xué)因素。因此，本研究在HSL基因區(qū)選擇位于第6號內(nèi)含子處代表性多態(tài)位點(CA)n，通過對比多態(tài)位點在優(yōu)秀耐力運動員與普通人群中的分布不同，探討其作為影響有氧耐力遺傳標(biāo)記的可能性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

運動員組123人，年齡23.10±5.10歲，其中男性56人，女性67人。運動專項為5/10 km或馬拉松跑，運動等級為健將或國際健將；普通人組127人，年齡21.53±1.30歲，其中男性71人，女性56人，均無運動專業(yè)訓(xùn)練背景。所有受試者均來自山東、河北、東北三省。所有研究對象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因組DNA 受試者肘靜脈取血，從全血中提取基因組DNA。

1.2.2 解析基因型 采用PCR結(jié)合熒光標(biāo)記復(fù)合STR-genescan方法解析HSL基因(CA)n 重復(fù)多態(tài)基因型。根據(jù)GenBank提供的HSL序列，用primier 5.0軟件設(shè)計引物。使用熒光標(biāo)記物FAM標(biāo)記上游引物5'端。上游引物：5'AGGCAGAGGAATCTAAG 3'；下游引物：5'CTGAGCGACATGACAC 3'。常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴增。

取3 μl擴增產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小。合格的PCR產(chǎn)物用于熒光基因掃描方法檢測。在ABI-3100DNA 測序儀上進(jìn)行電泳，以熒光吸收峰表示每個DNA片段。用Genotyper 軟件根據(jù)同一泳道標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(即內(nèi)標(biāo))遷移率計算出每一泳道遷移率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得出待測 DNA 片段分子量大小。最后將計算出的待測 DNA片段分子量與等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物比對，得出其基因型。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計基因型頻率和等位基因頻率，對不同分組的位點分布進(jìn)行哈溫平衡檢驗。運動員組和對照組間等位基因頻率和基因型頻率差別比較用χ2檢驗。進(jìn)一步對重復(fù)多態(tài)按某個分割點劃分為長短鏈兩個等位基因[7]，比較運動員組和對照組間等位基因頻率和基因型頻率差別。

2 研究結(jié)果

2.1 等位基因分布特征

HSL(CA)n重復(fù)多態(tài)PCR產(chǎn)物片段長度與掃描分析后的等位基因重復(fù)次數(shù)檢測結(jié)果見表1。

Tab. 1 PCR length and repeat times of (CA)n polymorphism(±s， n=10)

基因掃描結(jié)果顯示，HSL基因(CA)n重復(fù)多態(tài)共有9種不同重復(fù)次數(shù)的等位基因，對應(yīng)于1～9重復(fù)次數(shù)，116～132 bp PCR片段長度。圖1所示為部分HSL基因(CA)n重復(fù)多態(tài)經(jīng)基因掃描后FAM標(biāo)記的吸收峰。(圖1A)所示PCR產(chǎn)物長度為124 bp、126 bp，等位基因為(CA)5、(CA)6，基因型為5/6雜合型；(圖1B)所示PCR產(chǎn)物長度為120 bp、122 bp，等位基因為(CA)3、(CA)4，基因型為3/4雜合型；(圖1C)所示PCR產(chǎn)物長度120 bp、126 bp，等位基因為(CA)3、(CA)6，基因型為3/6雜合型。

Fig.. 1 Genescan of (CA)n polymorphism A: Genetype of 5/6； B: Genetype of 3/4； C: Genetype of 3/6

HSL基因(CA)n重復(fù)多態(tài)在各組間均符合哈溫平衡(P>0.05)。等位基因分布情況見表2。其中，以5次重復(fù)等位基因分布頻率為最多，在對照組中的分布頻率為56%，在運動員中的分布頻率為58%。其次為4次和6次重復(fù)等位基因，在對照組中的分布頻率均為11%，而在運動員組中的分布頻率均為13%。

Tab. 2 Distribute features of (CA)n allele

卡方檢驗結(jié)果顯示，等位基因的分布在對照組和運動員組沒有顯著性差異。對運動員組再分層分析，馬拉松組、5/10 km組分別與對照組相比，均無顯著性差異。按(CA)n不同重復(fù)次數(shù)為分割點，將(CA)n等位基因劃分為≥分割點(長鏈組)和<分割點組(短鏈組)進(jìn)行分析。按分割點分組后的等位基因分布特征見表3。

卡方檢驗結(jié)果顯示，當(dāng)分別以4、5、6、7、8、9重復(fù)次數(shù)為分割點劃分短鏈和長鏈進(jìn)行比較時，等位基因的分布在對照組和運動員組沒有顯著性差異。對運動員組再分層分析，馬拉松組、5/10 km組分別與對照組相比，均無顯著性差異。

Tab. 3 Distribute features of (CA)n allele (grouped by segmentation points)

AlleleControl(n=127)Athlete(n=123)5/10km(n=93)Marathon(n=30)≥4223(0.88)226(0.92)172(0.92)54(0.9)<431(0.12)20(0.08)14(0.08)6(0.1)≥5195(0.77)195(0.79)147(0.79)48(0.8)<559(0.23)51(0.21)39(0.21)12(0.2)≥6201(0.79)193(0.78)143(0.77)50(0.83)<653(0.21)53(0.22)43(0.23)10(0.17)≥725(0.1)20(0.08)14(0.08)6(0.1)<7229(0.9)226(0.92)172(0.92)54(0.9)≥818(0.07)10(0.04)6(0.03)4(0.07)<8236(0.93)236(0.96)180(0.97)56(0.93)≥95(0.02)3(0.01)3(0.02)0(0)<9249(0.98)243(0.99)183(0.98)60(1)

2.2 基因型分布特征

HSL基因(CA)n重復(fù)多態(tài)基因型共25種，在對照組中觀察到23種基因型，在運動員組中，觀察到19種基因型。分布頻率最高的是5/5基因型。在對照組和運動員組中的分布頻率分別為35%和33%。在對照組中，沒有發(fā)現(xiàn)4/9、4/7基因型，在運動員組中，沒有發(fā)現(xiàn)3/7、3/8、4/8、6/9、7/7、8/8基因型(表4)。

Tab. 4 Distribute features of (CA)n genotype

卡方檢驗結(jié)果顯示，基因型的分布在對照組和運動員組沒有顯著性差異。對運動員組再分層分析，馬拉松組、5/10 km組分別與對照組相比，均無顯著性差異。將HSL基因(CA)n重復(fù)多態(tài)的等位基因重復(fù)按分割點劃分為長短鏈兩個等位基因：即S(短鏈)等位基因和L(長鏈)等位基因。則存在三個基因型，即SS、SL和LL。按SS+SL和LL分組分析，即(CA)n重復(fù)次數(shù)均大于某一分割點組成的基因型為一組，其他基因型為一組，進(jìn)行兩組間比較分析。HSL基因(CA)n基因型按分割點分組后的分布特征見表5。

Tab. 5 Distribute features of (CA)n genotype (grouped by segmentation points)

GenotypeControl(n=127)Athlete(n=123)5/10km(n=93)Marathon(n=30)≥4(LL)97(0.76)105(0.85)81(0.87)*24(0.8)<4(SS+SL)30(0.24)18(0.15)12(0.13)*6(0.2)≥575(0.59)78(0.63)60(0.65)18(0.6)<552(0.41)45(0.37)33(0.35)12(0.4)≥613(0.1)10(0.08)9(0.1)1(0.03)<6114(0.9)113(0.92)84(0.9)29(0.97)≥72(0.02)0(0)0(0)0(0)<7125(0.98)123(1)93(1)30(1)≥81(0.01)0(0)0(0)0(0)<8126(0.99)123(1)93(1)30(1)

*P<0.05vscontrol group

卡方檢驗結(jié)果顯示，當(dāng)以4重復(fù)次數(shù)為分割點劃分短鏈和長鏈等位基因進(jìn)行比較時，基因型的分布在對照組和運動員組沒有顯著性差異。對運動員組再分層分析，馬拉松組與對照組相比，無顯著性差異，5/10 km組與對照組相比，有顯著性差異(P<0.05)。

當(dāng)分別以5、6、7、8重復(fù)次數(shù)為分割點劃分短鏈和長鏈等位基因進(jìn)行比較時，基因型的分布在對照組和運動員組沒有顯著性差異。對運動員組再分層分析，馬拉松組、5/10 km組分別與對照組相比，均無顯著性差異。

3 討論

HSL基因位于第6號內(nèi)含子的(CA)n重復(fù)多態(tài)分布特征與人種關(guān)系密切，是目前研究較多的能量代謝相關(guān)位點。Magre等研究表明，白種人HSL第6號內(nèi)含子(CA)n等位多態(tài)中，n=5的等位基因頻率在2型糖尿病人中明顯升高，且這種關(guān)系是不依賴于肥胖的[8]。也有研究表明，該重復(fù)多態(tài)等位基因5是腹部脂肪細(xì)胞的分解代謝速率降低的標(biāo)記，與肥胖表型密切相關(guān)[9，10]。而在我國遵義地區(qū)漢族人群中，2型糖尿病患者HSL第6號內(nèi)含子(CA)n多態(tài)的等位基因9與2型糖尿病呈正關(guān)聯(lián)，等位基因5與2型糖尿病呈負(fù)關(guān)聯(lián)[11]。由此說明，HSL第6號內(nèi)含子(CA)n重復(fù)次數(shù)與能量代謝謝癥狀相關(guān)，但在不同人群中其作用不同。

基因多態(tài)性與耐力水平[5]以及運動訓(xùn)練敏感性[3]相關(guān)聯(lián)的研究報道較多。本研究中，在假設(shè)P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義的前提下，HSL基因的(CA)n多態(tài)當(dāng)以4重復(fù)次數(shù)為分割點劃分短鏈和長鏈等位基因進(jìn)行比較時，LL基因型在5/10 km運動員與對照組相比，在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。產(chǎn)生這種差異的原因，從基因功能學(xué)分析，HSL(CA)n重復(fù)多態(tài)位于基因第6內(nèi)含子處，其變異直接對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響的可能性較小，但有可能會影響基因的剪切或表達(dá)，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)量。由于該基因的功能是促進(jìn)脂肪的分解，其表達(dá)量的改變可能會影響脂肪的分解能力，使循環(huán)系統(tǒng)中游離脂肪酸的含量改變，從而影響了長跑運動員的運動能力。另外，有可能HSL(CA)n重復(fù)多態(tài)本身不會影響相關(guān)基因的表達(dá)，但其與某一能影響有氧耐力的功能型變異位點位于連鎖不平衡，因此，代表另一連鎖不平衡位點，成為了一個可檢測的遺傳標(biāo)記。

本研究是在假設(shè)P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義的前提下進(jìn)行的關(guān)聯(lián)性分析，其結(jié)果提示了可能在相關(guān)表型的發(fā)生中起作用的分子遺傳學(xué)標(biāo)記，為確定我國優(yōu)秀運動員基因選材的分子遺傳學(xué)標(biāo)記提供了參考。即當(dāng)以4重復(fù)次數(shù)為分割點劃分短鏈和長鏈等位基因進(jìn)行比較時，LL基因型有可能是5/10 km運動員的分子標(biāo)記，可以作為運動員選材的參考分子遺傳學(xué)指標(biāo)。但是遺傳標(biāo)記是否對基因表達(dá)真正的產(chǎn)生影響，則需要進(jìn)行基因功能的深入研究，為關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果提供直接的實驗證據(jù)，從而闡明關(guān)聯(lián)機制，這對研究人體運動能力這類復(fù)雜表型的發(fā)生機理非常重要[12]。

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Studies on association of HSL repeat polymorphism and aerobic endurance

XIA Xiao-hui1, XIA Hui-yun2, GUO Jie1, LIU Kang-chao1, HU Yang3△

(1. Lanzhou City university, 2. the Hospital of Changfeng Machinery Factory, Lanzhou 730070; 3. Beijing Sport University, Beijing 100084, China)

Objective: To investigate the relationship between hormone sensitive lipase (HSL) gene polymorphism and aerobic endurance. Methods: The (CA)n repeats polymorphism genotypes in HSL intro 6 of 123 outstanding long distance runners and 127 controls of Han nationality in northern China were analyzed by PCR and Fluorescence labeled STR-genescan. Repeat polymorphisms were grouped according to segmentation point and alleles were divided into long or short chains. Chi-square test was used to analyze the frequency difference of allelic and genotypic between athlete and control groups. Results: (CA)n repeats polymorphism in HSL gene was total of9 different repeat number of alleles, which composed of 25 different genotypes. The chi-square test result showed that when compared short and long chain alleles split by 4, there was a significant difference (P<0.05) of genotype distribution in 5/10 km group compared with control. Compared the rest groups with control, there was no significant difference. Conclusion: Compared short and long chain alleles split by 4, the LL genotype of (CA)n of HSL was associated with aerobic endurance and it might be a molecular marker of elite 5/10 km long distance runners.

hormone sensitive lipase; polymorphism; aerobic endurance; molecular marker

甘肅省自然科學(xué)基金(1208RJZA165)；國家科技攻關(guān)計劃項目(2003BA904B04)

2014-08-13 【修回日期】2014-10-28

R363.1

A

1000-6834(2015)01-093-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.027

△【通訊作者】Tel: 010-62989208； E-mail: hyyr1@163.com