連加辨， 吳枝娟， 方秋娟△， 余 靖， 何瑞嵐

(1. 三明職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室， 福建 三明 365000；2. 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 福州 350004)

?

阿魏酸鈉對(duì)幼大鼠心肌柔紅霉素?fù)p傷的保護(hù)作用*

連加辨1，2， 吳枝娟2， 方秋娟2△， 余 靖2， 何瑞嵐2

(1. 三明職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室， 福建 三明 365000；2. 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系， 福州 350004)

目的：探討阿魏酸鈉對(duì)幼齡大鼠心肌柔紅霉素(DNR)損傷的保護(hù)作用。方法：雄性幼SD大鼠40只，隨機(jī)分成4組(n=10):對(duì)照組(Control)、柔紅霉素組(DNR) 、阿魏酸鈉干預(yù)組(DNR+SF)和阿魏酸鈉單用組(SF)。采用腹腔注射DNR每周1次，連續(xù)4周，累積劑量10 mg/kg法建立未成熟心肌DNR損傷模型，于第1次注射DNR開始，每日SF(60 mg/kg)連續(xù)灌胃25 d。通過左心室插管測(cè)左心室壓力及其對(duì)異丙腎上腺素反應(yīng)；觀察大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變；Western blot 和RT-PCR 測(cè)大鼠心肌肌鈣蛋白I(cTNI) 表達(dá)。結(jié)果：SF干預(yù)抑制DNR損傷引起的心率下降(P<0.05)；增加大鼠左心室舒張末期壓力(LVEDP)、心率(HR)、左心室最大收縮速度(LVP+dp/dtmax)和左心室最大舒張速度(LVP-dp/dtmax)對(duì)異丙腎上腺素激發(fā)的增量(P<0.01)；改善心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷；抑制DNR損傷引起的心肌肌鈣蛋白I表達(dá)下降(P<0.05)。結(jié)論：阿魏酸鈉干預(yù)能減輕柔紅霉素所致幼齡大鼠心力儲(chǔ)備下降，可能與阿魏酸鈉能有效逆轉(zhuǎn)DNR致幼大鼠心肌收縮舒張相關(guān)蛋白cTNI表達(dá)下降有關(guān)。

阿魏酸鈉；柔紅霉素；心肌保護(hù)；異丙腎上腺素

以柔紅霉素(daunorubicin, DNR)為代表的蒽環(huán)類藥物(anthracycllne，ANTH)是白血病化療的基本藥物[1]。DNR被稱為“拓?fù)洚悩?gòu)酶毒物”可與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ上的酪氨酸殘基共價(jià)結(jié)合形成穩(wěn)定的中間體，從而影響DNA組裝、解螺旋、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，起抗腫瘤作用。但DNR具有強(qiáng)烈的心臟毒性，特別是對(duì)兒童心臟毒性，發(fā)生率高達(dá)65%，且無安全劑量閾值，表現(xiàn)為心律失常、充血性心力衰竭和(或)心肌病等，且多為不可逆性損傷，限制了其臨床應(yīng)用。阿魏酸鈉(sodium ferulate, SF)是中藥當(dāng)歸、川穹有效成份阿魏酸的鈉鹽，常用于血管性疾病輔助治療，使用安全。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SF可通過抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激從而抑制心肌細(xì)胞凋亡保護(hù)DNR損傷的心肌細(xì)胞[2]。本研究以幼齡大鼠為研究對(duì)象，建立DNR致未成熟心肌損傷模型[3]，模擬DNR對(duì)兒童心臟的損傷,同時(shí)給予SF干預(yù)，著重從模型動(dòng)物心力儲(chǔ)備狀態(tài)評(píng)價(jià)SF干預(yù)對(duì)DNR致未成熟心肌損傷影響，從心肌收縮舒張相關(guān)蛋白心肌特異性肌鈣蛋白I(cardiac Troponin I ,cTNI)表達(dá)改變，探討SF保護(hù)DNR致幼大鼠心臟損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

(24±3)日齡SD大鼠40只，體重60～80 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005)；RM6240C型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng), YPJ01H型壓力換能器(成都儀器廠)；PE50聚乙烯導(dǎo)管(Becton Dickinson 公司)；柔紅霉素(Pfizer公司)；阿魏酸鈉(閩東力捷迅藥業(yè)有限公司)；異丙腎上腺素(Sigma公司)。

1.2 制備阿魏酸鈉干預(yù)未成熟心肌柔紅霉素?fù)p傷模型

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為四組(n=10):對(duì)照組(Control)、柔紅霉素組(DNR)、阿魏酸鈉干預(yù)組(DNR+SF)和阿魏酸鈉組(SF)。Control組和SF組，均腹腔注射0.9%NaCl(NS), 5 ml/kg，每周1次，共4次；DNR組和SF干預(yù)組，均腹腔注射DNR(0.5 mg/ml)，5 ml/kg，每周1次，共4次，制備未成熟心肌DNR損傷模型。其中Control組和DNR組，自第1次注射DNR開始， NS灌胃，5 ml/kg·d,連續(xù)25 d；SF組和DNR +SF組， 12 mg/ml SF灌胃，5 ml/kg·d,連續(xù)25 d,制備SF干預(yù)未成熟心肌模型。SF末次給藥后第3天行各項(xiàng)檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)幼齡大鼠左心室內(nèi)壓評(píng)價(jià)靜息心功能

每組取6只大鼠，腹腔注射氨基甲酸乙酯( 1 g/kg) 麻醉、氣管插管，通過右頸總動(dòng)脈行左心室插管，通過壓力換能器接RM6240C型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，采樣頻率3 KHz，記錄左心室內(nèi)壓10 min，測(cè)心率(heart rate,HR)、最大收縮速度(left ventrivular max systolic spead, LVP+dp/dtmax)、左心室舒張末期壓(left ventrivular end diastolic pressure ,LVEDP)及最大舒張速度(left ventrivular max diastolic spead, LVP-dp/dtmax)等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)大鼠靜息心功能。

1.4 檢測(cè)幼齡大鼠左心室內(nèi)壓對(duì)異丙腎上腺素反應(yīng)評(píng)價(jià)心肌β腎上腺素受體功能

上述大鼠靜息心功能檢測(cè)后，經(jīng)左頸外靜脈插管注射生理鹽水(1 ml/kg) 10 min后，注射等體積異丙腎上腺素(25 ng/kg)觀察10 min，實(shí)驗(yàn)過程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)記錄左心室內(nèi)壓波，量化分析異丙腎上腺素對(duì)血流動(dòng)力學(xué)各指標(biāo)影響，評(píng)價(jià)心肌β腎上腺素受體功能。

1.5 幼齡大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

每組取3只大鼠處死取心臟，置4℃ PBS中沖洗殘血，取心尖部組織切成1 mm大小的組織塊浸于戊二醛溶液中固定，酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)制50～70 nm超薄切片，透射電子顯微鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.6 Western blot檢測(cè)心肌組織cTNI蛋白表達(dá)水平

取50 mg心室肌組織常規(guī)提取心室肌組織蛋白，用碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，加兔抗cTNI多克隆抗體(1∶800)4℃過夜，TBST洗膜3×10 min，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜3×10 min，化學(xué)發(fā)光，顯影定影。以GAPDH為內(nèi)參照，用圖像處理軟件Phoretix 1D分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.7 RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞cTNI mRNA 表達(dá)水平

上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成cTNI基因的引物，以GAPDH基因作為內(nèi)參照(表1)。取50 mg心室肌組織,Trizol法提取總RNA, 用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取1 μl cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng), 反應(yīng)條件：94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，28個(gè)循環(huán)； 循環(huán)后均72℃終延伸7 min，4℃保存。 PCR產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠電泳分析。電泳后在紫外燈下拍攝照片, 用圖像處理軟件Phoretix 1D分析目標(biāo)條帶的灰度值。

Tab. 1 Sequence of primers and length of PCR products

GenePrimers(5'-3')Size(bp)GAPDHF:5'-ACAGCAACAGGGTGGT-GGAC-3'R:5'-TTTGAGGGTG-CAGCGAACTT-3'252cTNIF:5'-CACCAGGGACACCCT-TCTAA-3'R:5'-ACTTGCCACGCAGGT-CATAG-3'485

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 SF干預(yù)對(duì)DNR損傷幼齡大鼠心功能影響

與Control組相比，DNR組大鼠靜息狀態(tài)下心率下降(P<0.05)，各組間LVDEP、+dp/dtmax、-dp/dtmax無明顯差別(表2)。與Control組相比，DNR組大鼠心臟對(duì)異丙腎上腺素引起的LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax增量減少(P<0.05)，心肌收縮和舒張潛能下降，心功能下降； SF干預(yù)組大鼠心臟對(duì)異丙腎上腺素引起的LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax增量較DNR組高(P<0.05)，SF干預(yù)逆轉(zhuǎn)DNR造成的幼大鼠心肌收縮和舒張潛能下降,提高心功能。SF單用組大鼠心臟對(duì)異丙腎上腺素引起的LVEDP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax增量無明顯差別，SF單用對(duì)心功能無影響(表3)。

GroupLVEDP(mmHg)HR(b/min)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)Control-2.38±4.58413±5220106±3651-10196±1056DNR0.15±2.42305±38*17675±3576-9043±1359DNR+SF0.12±1.44301±3618441±2609-9692±826SF-2.97±1.52352±6421055±3182-10430±1469

LVEDP：Left ventrivular end diastolic pressure; HR：Heart rate; +dp/dtmax：Left ventrivular max systolic spead; -dp/dtmax： Left ventrivular max diastolic spead； DNR: Daunorubicin； SF: Sodium ferulate

*P<0.05vscontrol

GroupLVEDPHR+dp/dtmax-dp/dtmaxControl0.49±0.060.24±0.130.28±0.130.38±0.21DNR0.03±0.26*0.01±0.08*-0.01±0.06*-0.10±0.09*DNR+SF0.29±0.30#0.08±0.06#0.06±0.12#0.08±0.16#SF0.45±0.120.25±0.010.27±0.040.41±0.15

LVEDP： Left ventrivular end diastolic pressure； HR： Heart rate； +dp/dtmax： Left ventrivular max systolic spead； -dp/dtmax：Left ventrivular max diastolic spead； DNR: Daunorubicin； SF: Sodium ferulate

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsDNR

2.2 SF干預(yù)對(duì)DNR損傷幼齡大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響

透射電子顯微鏡下, DNR組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可見胞質(zhì)疏松，肌節(jié)排列紊亂，Z線模糊，肌纖維溶解、斷裂，線粒體固縮(圖1B)，同魏征人等[4]研究蒽環(huán)類藥物阿霉素對(duì)大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)影響結(jié)果一致。SF干預(yù)組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)較DNR組改善，胞質(zhì)較濃密，各種細(xì)胞器較清晰,肌纖維排列整齊，肌小節(jié)較清晰，Z線可見,線粒體豐富(圖1C)。Control組和SF單用組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)濃密，各種細(xì)胞器清晰可見,肌節(jié)排列整齊，Z線清晰，肌小節(jié)清晰可見，肌絲明顯(圖1A、D)。

Fig.. 1 Electronograph of myocardium(×10 k) A: Control group; B: DNR group; C: DNR+SF group; D: SF group; DNR: Daunorubicin; SF: Sodium ferulate

2.3 SF干預(yù)對(duì)DNR損傷幼齡大鼠心肌組織cTNI蛋白表達(dá)影響

與Control組相比，DNR組大鼠心肌組織cTNI蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)；SF干預(yù)組大鼠心肌組織cTNI蛋白表達(dá)下降但較DNR組高(P<0.05)；SF單用組大鼠心肌組織cTNI蛋白表達(dá)無明顯改變(圖2)。

2.4 SF干預(yù)對(duì)DNR損傷幼齡大鼠心肌組織cTNI mRNA表達(dá)影響

與Control組相比，DNR組大鼠心肌組織cTNI基因表達(dá)明顯下降(P<0.05)；SF干預(yù)組大鼠心肌組織cTNI基因表達(dá)下降但較DNR組高(P<0.05)；SF單用組大鼠心肌組織cTNI基因表達(dá)無明顯改變(圖3 )。

3 討論

白血病是兒童常見癌癥，而DNR是白血病最常用的化療藥之一，但DNR存在明顯的心臟毒性，表現(xiàn)為急性心臟損傷和慢性心臟損傷。DNR致心臟慢性損傷是DNR的嚴(yán)重副作用，特別對(duì)兒童有較大危險(xiǎn)性，因此癌癥患兒使用DNR化療中心臟毒性問題倍受臨床關(guān)注[5]。β腎上腺素信號(hào)系統(tǒng)異常是人和動(dòng)物心肌病的特點(diǎn)之一，是缺血、非缺血性心肌病和慢性心功能不全的共同表現(xiàn)[6]。肌鈣蛋白是肌肉收縮調(diào)節(jié)蛋白，由肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白C 三個(gè)不同亞基組成。心肌肌鈣蛋白I(cTNI)僅存于心房肌和心室肌中，具有高度的心肌特異性，對(duì)心肌損傷程度具有高度敏感性?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，心臟對(duì)異丙腎上腺素的收縮舒張反應(yīng)與收縮蛋白cTNI量和對(duì)鈣的親和力變化有關(guān)[7]。本研究通過異丙腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)(isoprenaline provocation test,IPT)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNR損傷的心肌表現(xiàn)為β腎上腺素受體去敏化心力儲(chǔ)備下降與前期研究結(jié)果一致[3]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)DNR損傷幼齡大鼠心肌cTNI表達(dá)也下降，提示心肌cTNI表達(dá)量與心功能相關(guān)。

SF是中藥當(dāng)歸、川穹有效成份阿魏酸的鈉鹽，具有明確的心臟保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)SF中的苯烯結(jié)構(gòu)可以拮抗內(nèi)皮素的生物活性，對(duì)心肌缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用；通過調(diào)節(jié)前列環(huán)素(PGI2)和血栓素(A2)干預(yù)抑制血小板凝集和3H-SHT從血小板中釋放改善心臟功能；通過對(duì)抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化、減輕心臟氧化應(yīng)激損傷[8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SF能通過清除活性氧，降低過氧化損傷，抑制心肌細(xì)胞線粒體途徑凋亡減輕DNR的心肌毒性[2]。心肌氧化應(yīng)激損傷時(shí)可激活細(xì)胞中MAP激酶，通過 p38MAPK-iPLA2-cTNI途徑影響心肌β腎上腺素受體敏感性影響心功能[9]。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上[2, 3, 10],建立DNR致幼大鼠心肌損傷模型，模擬DNR對(duì)兒童心臟的損傷，同時(shí)給予SF灌胃干預(yù)，運(yùn)用異丙腎上腺素實(shí)驗(yàn)從模型動(dòng)物心力儲(chǔ)備狀態(tài)評(píng)價(jià)SF干預(yù)對(duì)DNR致未成熟心肌損傷影響，心肌超微結(jié)構(gòu)觀察和心肌cTNI表達(dá)改變探討SF對(duì)DNR損傷心肌保護(hù)機(jī)制。研究結(jié)果顯示，SF干預(yù)DNR損傷的心肌，逆轉(zhuǎn)DNR損傷引起的心力儲(chǔ)備下降；抑制肌纖維降解；反向調(diào)節(jié)DNR所致幼齡大鼠心肌細(xì)胞cTNI基因和蛋白質(zhì)表達(dá)下降。

綜上，結(jié)合課題組前期的研究結(jié)果[2]，本研究表明，SF干預(yù)DNR損傷的幼齡大鼠心肌，減輕DNR損傷的幼大鼠心肌的氧化應(yīng)激可能通過調(diào)控心肌細(xì)胞的p38MAPK-iPLA2-cTNI信號(hào)通路，反向調(diào)節(jié)cTNI基因和蛋白質(zhì)表達(dá),改善心功能，保護(hù)DNR損傷幼大鼠心肌。然而目前，SF減輕DNR損傷心肌氧化應(yīng)激和調(diào)控心肌cTNI基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的具體機(jī)制，仍尚未完全明確，有待于進(jìn)一步研究。

[1] Weiss RB. The anthracyclines: will we ever find a better doxorubicin[J].SeminOncol, 992, 19(6): 670-686.

[2] Wu ZJ, Yu J, Fang QJ,etal. Sodium ferulate protects against daunorubicin-induced cardiotoxicity by inhibition of mitochondrial apoptosis in juvenile rats[J].JCardiovascPharmacol, 2014, 63(4): 360-368.

[3] 方秋娟， 連加辨， 吳枝娟， 等. 柔紅霉素致幼大鼠慢性心力衰竭模型建立與評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(02): 113-115.

[4] 魏征人， 陳智嘉， 張春璐， 等. 黃芪注射液對(duì)阿霉素所致心肌病理改變和超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(05): 404-405.

[6] Sakthivel S, Finley NL, Rosevear PR,etal. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation[J].JBiolChem, 2005, 280(1): 703-714.

[7] Carroll R, Yellon DM. Delayed cardioprotection in a human cardiomyocyte-derived cell line: the role of adenosine, p38MAP kinase and mitochondrial KATP[J].BasicResCardiol, 2000, 95(3): 243-249.

[8] Xu X, Xiao H, Zhao J,etal. Cardioprotective effect of sodium ferulate in diabetic rats[J].IntJMedSci, 2012, 9(4): 291-300.

[9] Smith LW, Mcdonough KH. Inotropic sensitivity to beta-adrenergic stimulation in early sepsis[J].AmJPhysiol, 1988, 255(4 Pt 2): H699-703.

[10]Fang Q, Kan H, Lewis W,etal. Dilated cardiomyopathy in transgenic mice expressing HIV Tat[J].CardiovascToxicol, 2009, 9(1): 39-45.

Sodium ferulate protects against daunorubicin-induced cardiotoxicity in juvenile rats

LIAN Jia-bian1, 2, WU Zhi-juan2, FANG Qiu-juan2△, YU Jing2, HE Rui-lan2

(1. Department of Base Clinical, Sanming Vocational Technical College, Sanming 365000；2. Department of Physiology and Pathophysiology, Base Clinical College, Fujiang Medical University, Fuzhou 350004, China)

Objective: To investigate the protect effects of sodium ferulate (SF) on the daunorubicin(DNR)-induced cardiotoxicity in juvenile rats. Methods: Forty male juvenile SD rats were randomly divided into control group (Control), daunorubicin group (DNR), sodium ferudate treatment group (DNR+SF), sodium ferudate group (SF)(n=10). Juvenile rats were intraperitoneally treated with DNR (2.5 mg/kg every week for a cumulative dose of 10 mg/kg) preparation immature myocardial injury model in presence with SF (60 mg/kg) oral treatment for 25 days. The left ventricular pressure and its response to isoproterenol were measured using left ventricular catheter. Rat myocardium myocardial pathology specimens and ultrastructure changes were also observed. The expression of cardiac Troponin I (cTNI) was detected by Western blot and RT-PCR. Results: SF treatment could inhibit the decreasing of heart rates induced by DNR damage (P<0.05); it could increase the left ventrivular end diastolic pressure(LVEDP), heart rate, the maximal left ventrivular systolic speed(LVP+dp/dtmax) and the maximal left ventrivular diastolic speed (LVP-dp/dtmax) responding to isoproterenol stimulation(P<0.01); SF also could improve the myocardial ultrastructure injuries and inhibit the decreasing of cTNI expression caused by DNR damages (P<0.05). Conclusion: SF treatment could alleviate the decreasing of cardiac reservation induced by DNR damages in juvenile rats, which might be related to its reversing the effects on the cardiac systolic and diastolic function injuries and its inhibiting effects on the decreasing of cTNI expression caused by DNR. The mechanism of SF preventing daunorubicin-induced cardiotoxicity in juvenile rats is relevant to inhabited cardiac Troponin I expression.

sodium ferulate； daunorubicin； myocardial protection; isoproterenol

福建省自然科學(xué)基金(2011J05069)；福建醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金(2010bs007)；福建省教育廳中青年教師教育科研項(xiàng)目(JA14442)

2014-06-23 【修回日期】2014-10-14

R322.1

A

1000-6834(2015)01-054-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.016

△【通訊作者】Tel： 18906087901； E-mail： 514096301@qq.com