苗笑梅， 程世翔， 楊 震， 張 賽， 韓宛君， 涂 悅△， 孫洪濤△

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué), 天津 300193； 2. 天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室、武警腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所、武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院, 天津 300162)

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十二井穴刺絡(luò)放血聯(lián)合亞低溫治療對顱腦創(chuàng)傷急性期大鼠腦水腫的影響*

苗笑梅1,2， 程世翔1,2， 楊 震2， 張 賽2， 韓宛君2， 涂 悅2△， 孫洪濤2△

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué), 天津 300193； 2. 天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室、武警腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所、武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院, 天津 300162)

目的：探討十二井穴刺絡(luò)放血聯(lián)合亞低溫對顱腦創(chuàng)傷(TBI)大鼠急性期腦水腫的影響。方法：將75只健康成年雄性SD大鼠隨機分為5組(n=15)：假手術(shù)組(Sham)、顱腦創(chuàng)傷組(TBI)、放血組(BL)、亞低溫組(MIH)、放血聯(lián)合亞低溫組(BL+MIH)。采用電子腦皮質(zhì)損傷撞擊儀(eCCI)建立大鼠TBI模型，BL組于傷后即刻行十二井穴刺絡(luò)放血，每日2次；MIH組在傷后即刻采用亞低溫冰毯使體溫降至32℃，持續(xù)干預(yù)6 h。傷后48 h分別采用核磁共振成像技術(shù)(MRI)觀察腦水腫變化(n=3)、神經(jīng)功能缺損評分(mNSS)觀察行為學(xué)改變及干/濕重法測定腦含水量(n=8)、伊文思藍(lán)染色(EB)檢測血腦屏障通透性(BBB)(n=4)。結(jié)果：MRI顯示，TBI組腦水腫及血腫明顯，中線明顯偏移；而干預(yù)組較TBI組水腫明顯減輕，中線居中。與TBI組比較，各干預(yù)組mNSS評分均明顯改善(P<0.05)，而且BL+MIH組優(yōu)于單獨BL和MIH組(均P<0.01)；各干預(yù)組腦含水量也有不同程度降低(P<0.05)，尤以MIH組和BL+MIH組降低最為顯著(P<0.01)；各干預(yù)組血腦屏障通透性均有明顯改善(均P<0.01)，而且MIH組和BL+MIH組顯著優(yōu)于單獨BL組(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論：十二井穴刺絡(luò)放血和亞低溫均可以降低神經(jīng)功能缺陷評分，減輕腦水腫，降低血腦屏障通透性，對創(chuàng)傷性大鼠腦組織有保護(hù)作用，且二者聯(lián)合治療效果更加明顯。

十二井穴；亞低溫；顱腦創(chuàng)傷；腦水腫；放血；大鼠

隨著我國交通業(yè)和建筑業(yè)的飛速發(fā)展，由交通事故及高空墜落等意外事件導(dǎo)致的顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injury，TBI)事件頻頻發(fā)生，病情發(fā)展快，致殘、致死率高，目前已成為嚴(yán)重威脅人類生命安全的疾病之一。而創(chuàng)傷性腦水腫則是TBI急性期最重要的繼發(fā)性病理生理反應(yīng)[1]，由于過多水分聚集于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外間隙，會導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高以及腦體積增大，甚至引起腦疝，是TBI致殘、致死的首要原因。

目前認(rèn)為，刺絡(luò)放血(bloodletting，BL)療法是我國傳統(tǒng)急救方法之一，起源較早并且療效值得肯定，尤其是十二井穴刺絡(luò)放血自古便應(yīng)用于治療尸厥昏迷，通過刺絡(luò)放血能改善腦水腫狀態(tài)[2,3]。亞低溫(mild-induced hypothermia，MIH)作為TBI聯(lián)合治療的手段之一，是指用物理方法將患者體溫降低到32℃～35℃溫度范圍內(nèi)的低溫治療方法，能減輕TBI后一系列不良反應(yīng)，降低顱內(nèi)壓、減輕創(chuàng)傷性腦水腫，發(fā)揮腦保護(hù)作用，并已在臨床上形成了一定的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)[4,5]。然而對于十二井穴刺絡(luò)放血聯(lián)合亞低溫對TBI后腦水腫影響的研究鮮有報道。本研究在建立TBI大鼠模型基礎(chǔ)上進(jìn)行二者單獨以及聯(lián)合干預(yù)，探討其對TBI后腦水腫的影響以及為今后TBI的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

75只成年健康雄性SD大鼠(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，體重為280～300 g)，編號稱重后按數(shù)字表隨機分為5組(n=15)：假手術(shù)組(Sham)、顱腦創(chuàng)傷組(TBI)、放血組(BL)、亞低溫組(MIH)、放血聯(lián)合亞低溫組(BL+MIH)。

1.2 建立腦皮質(zhì)撞擊致TBI大鼠模型

實驗前實驗大鼠禁食12 h，不禁水。5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉后，取俯臥位置于立體定向頭架，無菌條件下于中線切開頭皮，剝離骨膜，暴露右頂骨。在前囟人字縫尖連線中點偏右2 mm，使用顱鉆開直徑為4.5 mm的圓形骨窗，暴露完整硬腦膜，待出現(xiàn)夾尾反射后開始打擊。調(diào)整電子控制性腦皮質(zhì)撞擊儀(electric controlled cortical impactor，eCCI，美國Custom Design公司)打擊臂與垂直方向角度20°，設(shè)定打擊深度3 mm、打擊速率4 m/s、打擊最低點持續(xù)時間120 ms，使用直徑為3 mm打擊帽精確撞擊大鼠腦皮質(zhì)。致傷后即刻給予小動物呼吸機維持通氣，徒手心外按壓搶救，觀察到自主呼吸恢復(fù)后縫合頭皮切口。Sham組大鼠正常開骨窗但不行撞擊。

1.3 十二井穴刺絡(luò)放血及亞低溫干預(yù)

(1)十二井穴刺絡(luò)放血：用1 ml注射器針頭于大鼠雙側(cè)前肢趾端的十二井穴點刺出血，出血量為每穴20 μl，每日2次，穴位定位方法采用比較解剖學(xué)，參考人體相應(yīng)穴位解剖標(biāo)志。(2)亞低溫：應(yīng)用亞低溫治療儀(CSZ 公司，美國)行大鼠亞低溫處理，即采用冰毯體表降溫，用HP-V26溫度測定儀連續(xù)監(jiān)測肛溫使體溫維持在(32.0±0.5)℃，持續(xù)6 h，之后用頭燈在1 h內(nèi)緩慢加熱復(fù)溫至(37.0±0.3)℃。(3)放血聯(lián)合亞低溫：進(jìn)行井穴刺絡(luò)放血和亞低溫聯(lián)合干預(yù)。各干預(yù)組均在傷后48 h取材。

1.4 磁共振成像

致傷48 h后，采用3.0 T磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI，德國西門子公司verio-3.0 T)監(jiān)測大鼠傷后腦水腫的變化情況。將麻醉后的大鼠自嗅溝水平向尾側(cè)作連續(xù)冠狀位，獲取T2加權(quán)圖像。具體參數(shù)為：重復(fù)時間(repetition time，TR)=4 000 ms，有效回波時間(echo time，TE)=75 ms，矩陣 320×320。實驗大鼠俯臥，冠狀面掃描，各序列采集20層，層厚2 mm，間距0.1 mm。

1.5 神經(jīng)功能缺損評分

實驗大鼠在致傷48 h后，由不了解實驗分組情況、經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的研究人員，應(yīng)用神經(jīng)功能缺損評分(modified neurological severity scores，mNSS)[6]，對實驗大鼠傷后的運動、感覺、提尾、平衡和反射等行為學(xué)損害程度進(jìn)行評價。總得分最低為0分，提示大鼠完全正常，沒有神經(jīng)功能缺陷；最高是18分，提示大鼠意識喪失或死亡。

1.6 腦含水量

采用干/濕重法測定腦組織含水量[7]。于傷后48 h斷頭取腦，棄去小腦和雙側(cè)嗅球，濾紙吸干表面水分，稱量大腦濕重后，置于110℃恒溫箱中烘烤24 h至恒重，稱量干重。腦含水量 =(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 血腦屏障通透性

采用伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)染色法檢測血腦屏障通透性[8]。實驗大鼠于處死前2 h經(jīng)股靜脈注射2% EB(3 ml/kg)，出現(xiàn)眼結(jié)膜及口唇、四肢變藍(lán)后斷頭取腦。取損傷灶周邊皮質(zhì)置于5 ml甲酰胺中，充分勻漿后置于37℃水浴箱中孵育24 h。12 000 r/min離心20 min后，收集上清液，用酶標(biāo)儀(Thermo，λ = 620 nm)測定光密度(OD)值。用倍比稀釋法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算腦組織EB含量(μg/g)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠MRI影像學(xué)表現(xiàn)

T2加權(quán)像顯示致傷側(cè)腦組織損傷改變，皮層的高信號區(qū)域提示損傷灶范圍，損傷區(qū)出現(xiàn)部分極高信號考慮存在血腫形成。結(jié)果表明：Sham組MRI表現(xiàn)正常，未見異常信號影，中線結(jié)構(gòu)居中。TBI組損傷處腦皮層有明顯的挫傷，周圍腦組織伴有水腫及血腫，中線明顯偏移。BL組水腫范圍縮小，中線輕微偏移。MIH組損傷范圍變化不明顯，水腫區(qū)較TBI組減小，中線基本無明顯偏移。BL+MIH組水腫面積進(jìn)一步減小，中線居中(圖1)。

Fig. 1 T2-weighted images show TBI signal observation at different groups Sham：Sham-operation group； TBI： Traumatic brain injury group； BL： Bloodletting group; MIH: Mild-induced hypothermia group； BL+MIH： BL and MIH group

2.2 大鼠神經(jīng)功能改變

大鼠TBI后神經(jīng)功能受損，表現(xiàn)為平衡功能障礙，不能沿直線行走，感覺功能障礙，飲食攝水減少。與Sham組相比，差異顯著(P<0.01)。與TBI組(13.25±0.67)相比，BL組(6.13±1.36)、MIH組(5.88±1.54)、BL+MIH組(2.38±0.99)mNSS評分均有明顯下降(P<0.05)，尤以BL+MIH組降低最為顯著(P<0.01)，其評分與Sham組(1.75±0.67)已無差異。此外，BL+MIH組mNSS評分較BL組、MIH組均有明顯降低(P<0.05，圖2)。

2.3 大鼠腦組織含水量改變

與Sham組(76.9±0.6)% 比較，大鼠致傷48 h后均出現(xiàn)不同程度的腦水腫：TBI組(79.9±1.1)%、BL組(78.8±0.8)%、MIH組(78.6±0.7)%、BL+MIH組(77.8±1.0)%(P<0.05，P<0.01)，而BL組的腦含水量較TBI組降低(P<0.05)，尤以MIH組和BL+MIH組下降最為顯著(P<0.01，圖3)。

2.4 大鼠血腦屏障通透性改變

與Sham組(2.5±0.6)μg/g比較，TBI組EB含量(5.5±0.4)μg/g明顯上升(P<0.01)，提示血腦屏障受損程度加重。而BL組(4.2±0.5)μg/g、MIH組(3.1±0.5)μg/g、BL+MIH組(2.9±0.6)μg/g。血腦屏障通透性均較TBI組明顯下降(P<0.01)，特別是MIH組、BL+MIH組已與Sham組無差異(圖4)。

Fig. 2 Neurological severity scores of rats at 48 hours after injury Sham：Sham-operated group； TBI： Traumatic brain injury group； BL： Bloodletting group; MIH: Mild-induced hypothermia group； BL+MIH： BL and MIH group*P<0.05，**P<0.01vsshan group；#P<0.05，##P<0.01vsTBI group；△P<0.05vsBL group；▲P<0.05vsMIH group

Fig. 3 Brain water content of rats at 48 hours after TBI(%) Sham： Sham-operation group； TBI： Traumatic brain injury group； BL： Bloodletting group; MIH: Mild-induced hypothermia group； BL+MIH： BL and MIH group*P<0.05，**P<0.01vssham group；#P<0.05，##P<0.01vsTBI group

3 討 論

TBI是由機械性外力作用導(dǎo)致的腦組織局限性或彌散性的原發(fā)性損傷，而在致傷后的數(shù)分鐘～數(shù)天內(nèi)會出現(xiàn)諸如腦水腫、顱內(nèi)壓升高、腦血流量改變等繼發(fā)性損傷，進(jìn)而加重腦組織的原發(fā)性損害[9]，尤其是創(chuàng)傷性腦水腫發(fā)展較快而且致殘、致死率極高[10]。創(chuàng)傷性腦水腫主要有兩種類型：血管源性腦水腫是由于TBI后血腦屏障內(nèi)皮連接障礙，造成內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，引起血管漏，這與腦挫傷和腦水腫有關(guān)；細(xì)胞毒性腦水腫是由于神經(jīng)細(xì)胞膜機械性損傷，造成大量鉀離子外流、鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，這與傷后腦組織的缺血、缺氧有關(guān)。在醫(yī)學(xué)發(fā)展進(jìn)程中，中醫(yī)與西醫(yī)對此疾病的研究都做出了卓越貢獻(xiàn)。因此，尋找有效的中西醫(yī)方法防控腦水腫可以降低TBI患者死亡率，提高生存質(zhì)量。

Fig. 4 Evan’s blue(EB) content in the damage zone at 48 h after injury Sham： Sham-operated group； TBI： Traumatic brain injury group； BL： Bloodletting group; MIH: Mild-induced hypothermia group； BL+MIH： BL and MIH group**P<0.01vssham group;##P<0.01vsTBI group

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)是一個巨大的寶庫，千百年來積累了大量的臨床經(jīng)驗，其中井穴刺絡(luò)放血作為中醫(yī)傳統(tǒng)的急救措施之一，療效值得肯定?！夺t(yī)宗金鑒·刺灸心法要訣》中指出：“商陽主刺卒中風(fēng)，暴仆昏沉痰涎壅，少商、中沖、關(guān)沖、少澤、商陽，使氣血流行，乃起死回生救急之妙穴”。另外，《針灸大成》中也說：“凡初中風(fēng)跌倒，卒暴昏沉……急以三棱針刺手十指十二井穴，當(dāng)去惡血……乃起死回生妙訣”，可見十二井穴刺絡(luò)放血是古代急救昏迷以促醒的重要方法，療效確切。據(jù)報道，十二井穴刺絡(luò)放血能抑制缺血區(qū)H+的堆積，調(diào)控K+、Na+濃度，阻止Ca2+內(nèi)流，對離子濃度有重要的良性調(diào)節(jié)作用，且能調(diào)節(jié)腦血流速度，對維持細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)、緩解細(xì)胞毒性水腫的發(fā)生和發(fā)展具有積極作用[11-13]，而創(chuàng)傷性腦水腫和缺血性腦水腫在發(fā)病機理和病理過程方面有某些相似之處，因此可以考慮手十二井穴放血對缺血性腦水腫的起效機制可能同樣作用于創(chuàng)傷性腦水腫。本實驗也表明井穴放血能夠降低腦含水量，促進(jìn)腦水腫及血腫的吸收。

而在現(xiàn)代研究中也早已證實，亞低溫對TBI性腦水腫有顯著療效，它能夠通過減少血容量、抑制炎癥以控制顱內(nèi)壓，進(jìn)而緩解血腦屏障滲漏[14]；也可通過調(diào)控緊密連接蛋白、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL-1β)而抑制血腦屏障的破壞[15]；還可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的釋放及水通道蛋白質(zhì)4(AQP-4)的過度表達(dá)以保護(hù)血腦屏障，降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性，減輕血管源性腦水腫[16-18]。此外，亞低溫能夠減少腦代謝，降低氧和葡萄糖的消耗，減少腦組織乳酸的堆積，使細(xì)胞的能量代謝維持在一個較低的水平，減少Ca2+內(nèi)流，阻斷鈣離子對神經(jīng)元的毒性，降低顱內(nèi)壓，抑制興奮性氨基酸、乙酰膽堿、兒茶酚胺等內(nèi)源性毒性產(chǎn)物對腦細(xì)胞的損害，減輕細(xì)胞毒性腦水腫，有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)[19-21]。通過此次實驗也驗證了亞低溫可以降低血腦屏障通透性，加速水腫吸收，具有神經(jīng)功能保護(hù)作用。

創(chuàng)傷性顱腦損傷病情嚴(yán)重[22, 23]，病理過程復(fù)雜，它使細(xì)胞中大量內(nèi)容物漏出，繼發(fā)神經(jīng)細(xì)胞壞死，炎性反應(yīng)，水、電解質(zhì)紊亂，腦含水量急劇增加，引發(fā)腦水腫及顱內(nèi)壓進(jìn)行性增加等一系列病理損害[24]。單一的治療方法很難達(dá)到預(yù)期效果，需要綜合利用各種方法，多管齊下，以期獲得滿意療效[25]。通過本實驗可以發(fā)現(xiàn)，十二井穴刺絡(luò)放血和亞低溫對TBI后神經(jīng)功能缺陷的改善有一定作用，且能降低腦水腫程度，穩(wěn)定血腦屏障通透性，并且從核磁影像學(xué)也能觀察到，干預(yù)組比模型組腦腫脹改善更明顯。

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Therapeutic bloodletting at Jing-well points combine hypothermia attenuated acute cerebral edema after traumatic brain injury in rats

MIAO Xiao-mei1, CHENG Shi-xiang1,2, YANG Zhen2, ZHANG Sai2, HAN Wan-jun2, TU Yue2△, SUN Hong-tao2△

(1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193; 2. Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair, Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience of China Armed Police Force; Neurology and Neurosurgery Hospital of China Armed Police Force, Tianjin 300162, China)

Objective: To investigate the influence of therapeutic bloodletting at Jing-well points and hypothermia on acute cerebral edema after traumatic brain injury (TBI) in rats. Methods: Seventy-five SD rats were randomly divided into sham-operation group (Sham), TBI group (TBI), bloodletting group (BL), mild-induced hypothermia group (MIH), and bloodletting plus MIH group (BL+MIH)(n=15). The model of TBI was established by electric controlled cortical impactor (eCCI). The rats of BL group were bloodletting at Jing-well points immediately after injury, twice daily. While the MIH group was settled on a hypothermia blanket promptly after TBI for 6 hours, so that the temperature dropped to 32 degrees. Each of measurement was performed after 48 hours. Magnetic resonance imaging (MRI) was used to evaluate the dynamic impairment of cerebral edema after TBI (n=3). In addition, mNSS score, measurements of wet and dry brain weight, and Evans Blue assay were performed to investigate the neurologic deficit, cerebral water content (n=8), and blood-brain barrier permeability(BBB), (n=4), respectively. Results: MRI analysis showed that the cerebral edema, hematoma and midline shifting of rats in TBI group was more serious than other treatment group. Meanwhile compared with TBI group, the mNSS scores of every treatment group were meaningfully lower (allP<0.05). Furthermore, treatment with BL+MIH group was superior to the separated BL and MIH group (allP<0.01). In addition, brain water content of each intervention group reduced to varying degrees (allP<0.05), especially that of MIH group and BL+MIH group (P<0.01). BBB permeability of each treatment group was also significantly improved (allP<0.01), and the improvement in MIH group and BL+MIH group was much better than the BL alone group (P<0.05,P<0.01). Conclusion: Our major finding is that bloodletting at Jing-well points and MIH can reduce cerebral edema and BBB dysfunction and exert neuroprotective effects after TBI. The results suggest that the combination of BL and MIH is more effective than other treatment being used alone.

jing-well points; mild-induced hypothermia; traumatic brain injury; brain edema; bloodletting; rat

天津市自然科學(xué)基金面上項目(12JCYBJC18500)；武警部隊后勤科研項目(WJHQ2012-20)；武警后勤學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊(WHTD201306)

2014-12-09

2015-03-02

R641

A

1000-6834(2015)03-249-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.015

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