王海華， 曾 瑾， 王海珍， 姜玉新， 王 靜， 周萍萍

(皖南醫(yī)學(xué)院生理教研室， 安徽蕪湖 241002)

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蜂膠總黃酮對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制*

王海華△， 曾 瑾， 王海珍， 姜玉新， 王 靜， 周萍萍

(皖南醫(yī)學(xué)院生理教研室， 安徽蕪湖 241002)

目的：探討蜂膠總黃酮(TFP)對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法：隨機(jī)選取6只雄性SD大鼠為正常對(duì)照(NC)組；余下大鼠采用腹腔注射阿霉素造模，將造模成功的大鼠隨機(jī)分成5組(n=6)：慢性心力衰竭模型(CHF)組、蜂膠總黃酮低劑量(LD)組、蜂膠總黃酮中劑量(MD)組、蜂膠總黃酮高劑量(HD)組和地高辛(DIG)組。6周后通過(guò)生物信號(hào)系統(tǒng)記錄大鼠血流動(dòng)力學(xué)相關(guān)指標(biāo)；檢測(cè)各組大鼠血漿中腦鈉肽(BNP)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量；取材后HE和Masson染色觀察心臟結(jié)構(gòu)改變及膠原纖維增生情況；Western blot檢測(cè)縫隙連接蛋白43(P-Cx43)表達(dá)水平；TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)果：與NC組相比，CHF組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)左室峰壓(LVSP)及左室內(nèi)壓變化速率(±dP/dtmax)絕對(duì)值明顯下降(P<0.01)，左室舒張期末壓(LVEDP)明顯升高(P<0.01)；血漿中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量均明顯升高(P<0.01)；與CHF組相比， MD、HD組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVSP和±dP/dtmax絕對(duì)值明顯升高(P<0.05)，LVEDP明顯降低(P<0.01)，LD組LVEDP明顯降低(P<0.01)，LVSP和±dP/dtmax變化均不明顯。MD、HD組大鼠血清中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量明顯降低(P<0.01)，LD組各指標(biāo)變化不明顯；Western blot結(jié)果顯示:與NC組相比，CHF組P-Cx43條帶明顯增粗，給予TFP灌胃后，隨著TFP劑量的增加，TFP各組P-Cx43條帶逐漸變細(xì)變淡；進(jìn)一步半定量分析顯示，與NC組相比，各組中P-Cx43表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與CHF組相比，TFP各組P-Cx43表達(dá)量均降低；MD組P-Cx43表達(dá)量低于LD組(P<0.01)，高于HD組(P<0.05)；CHF組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)(22.61±3.39)較NC組(1.12±0.24)明顯增高(P<0.01)；與CHF組相比，蜂膠總黃酮LD、MD、HD組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)分別為(15.79±2.80)、(9.28±2.10)、(4.73±1.14)均明顯低于CHF組(P<0.01)；大鼠心肌組織P-Cx43表達(dá)水平與心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論：蜂膠總黃酮呈劑量依賴(lài)性對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠慢性心力衰竭心肌細(xì)胞凋亡具有抑制作用，其機(jī)制可能與Cx43表達(dá)調(diào)控特別是磷酸化狀態(tài)的調(diào)控密切相關(guān)。

心力衰竭； 蜂膠總黃酮；縫隙連接通道；連接蛋白43；大鼠

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)已成為危害人類(lèi)身心健康的主要疾病之一[1]，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，心肌細(xì)胞凋亡在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用，神經(jīng)內(nèi)分泌[2,3]的活動(dòng)也與CHF時(shí)心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[4]。連接蛋白43(connexin 43,Cx43)構(gòu)成心肌細(xì)胞間縫隙連接(gap junction, GJ)通道，磷酸化和去磷酸化是心肌細(xì)胞膜上Cx43存在的兩種狀態(tài)，對(duì)GJ通道的功能起調(diào)控作用。梁慶等[5]報(bào)道CHF時(shí)磷酸化的縫隙連接蛋白43(P-Cx43)的含量升高，可能與GJ通道關(guān)閉，Cx43降解增加，從而影響細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-7]有關(guān)。

蜂膠是蜜蜂采集植物幼芽分泌物和樹(shù)脂等并混入其上顎腺分泌物混合加工而成的一種膠狀物，無(wú)毒副作用，其主要成分是黃酮類(lèi)化合物(total flavonoids of propolis,TFP)[8]，具有抗氧化、心肌保護(hù)及抗腫瘤等作用，有“紫色黃金”的美譽(yù)[9-11]。有關(guān)蜂膠對(duì)CHF過(guò)程中心肌損傷作用及其可能機(jī)制，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)阿霉素(adriamycin,ADR)誘導(dǎo)復(fù)制CHF大鼠模型[12]，通過(guò)蜂膠總黃酮灌胃給藥，檢測(cè)大鼠心功能、血漿腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、血漿腦鈉肽(brain natriuretic peptide,BNP)及心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)含量等指標(biāo)，經(jīng)HE和Masson染色觀察大鼠心肌形態(tài)學(xué)變化及膠原纖維增生情況，Tunel法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡和Western blot法檢測(cè)P-Cx43表達(dá)，旨在探討蜂膠總黃酮對(duì)CHF的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸阿霉素(德國(guó)Ruibio公司，RD7121)，用0.9%氯化鈉注射液溶解鹽酸阿霉素[13]，按每只大鼠2 mg/kg的劑量溶于1 ml生理鹽水。地高辛片(上海信誼藥廠有限公司，H31020678)，取地高辛片，用0.9%氯化鈉注射液配制成混懸液，按每只大鼠0.02 mg/kg 的劑量溶于1 ml生理鹽水。水溶性蜂膠(總黃酮14.7%，廣州市杰禾蜂業(yè)有限公司，批號(hào)：20121103-A)。

1.2 主要儀器與試劑

Medlab-U/8c生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)(南京美易公司)；倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；Model-680型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-3200PCS)；BECKMAN COULTER 微量臺(tái)式離心機(jī)(microfuge 22R centrifuge)；BNP酶聯(lián)免疫檢劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(horseradish peroxidase labeled, H+L)山羊抗兔IgG、(rabbit-anti-glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)Rabbit-Anti-GAPDH、cTnI酶聯(lián)免疫試劑盒、TNF-ɑ及IL-6試劑盒(合肥博美生物科技有限公司)；Masson三色染色液(Beijing Leagene Biotechnology Co.,Ltd)；Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(顯色法)(碧云天生物技術(shù)研究所)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠，體重(200±20)g，由合肥蜀山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SC×K(蘇)2009-0001]，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。隨機(jī)選6只大鼠為正常對(duì)照組(NC組)，模型組(CHF 組)大鼠通過(guò)腹腔注射阿霉素2 mg/kg，每周相同時(shí)間點(diǎn)注射1次，連續(xù)6周[13]，復(fù)制大鼠心力衰竭模型成功后，隨機(jī)將其分成蜂膠總黃酮低劑量組(LD 組)、蜂膠總黃酮中劑量組(MD 組)、蜂膠總黃酮高劑量組(HD組)和地高辛組(DIG 組)(n=6), 通過(guò)腹腔注射阿霉素2 mg/kg，每周相同時(shí)間點(diǎn)注射1次，連續(xù)6周，在第3次注射后，每日相同時(shí)間點(diǎn)分別以1 ml(以總黃酮含量為50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg)及0.02 mg/kg地高辛[14]對(duì)大鼠灌胃給藥，持續(xù)4周，分別為(LD組、MD組和HD組)和DIG 組，NC組和CHF組大鼠在每天相同時(shí)間點(diǎn)灌胃等容積的生理鹽水，其他步驟相同。

1.4 大鼠心功能檢測(cè)及樣本制備處理

6周后，通過(guò)生物信號(hào)系統(tǒng)檢測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，包括心率(heart rate,HR)、左室峰壓(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒張期末壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)及左室內(nèi)壓變化速率(maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure,±dp/dtmax)，穩(wěn)定15 min后，連續(xù)記錄30 min，取均值；完成后，由頸總動(dòng)脈取血，冷凍高速離心(3 000 r/min)10 min，取上清，-20℃分裝保存，用于生化指標(biāo)檢測(cè)；稱(chēng)取并計(jì)算大鼠心重/體重比值(heart weight/body weight,HW/BW)，留取大鼠心室的心尖部及心底部，心尖部用于Western blot檢測(cè)；心底部4%多聚甲醛固定，通過(guò)HE和Masson染色觀察其形態(tài)學(xué)及膠原纖維增生情況。

1.5 Western blot半定量檢測(cè)P-Cx43表達(dá)

測(cè)定大鼠心尖部左心室總蛋白質(zhì)濃度，每孔加入50 μg的總蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE(10%的分離膠)電泳，電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。1∶400 P-Cx43兔抗鼠多克隆抗體[購(gòu)自英國(guó)艾博抗貿(mào)易有限公司，Abcam上海辦事處(phospho S368)antibody ab30559],4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h，以GAPDH(1∶2 000)抗體作內(nèi)參照。洗膜后ECL試劑顯影。

1.6 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

通過(guò)TUNEL檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)檢測(cè)各組大鼠心肌組織中的凋亡細(xì)胞。光鏡下正常細(xì)胞核顯藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一棕黃色(TUNEL陽(yáng)性)。每只大鼠觀察4張切片，每張切片上隨機(jī)選取計(jì)數(shù)5個(gè)視野(×400)，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)占總細(xì)胞總數(shù)百分比，取其平均值為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 蜂膠總黃酮對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)顯示，與NC組相比，CHF組大鼠心臟LVSP及±dP/dtmax絕對(duì)值明顯下降(P<0.01)，LVEDP明顯升高(P<0.01)；與CHF組相比， MD、HD及DIX組大鼠LVSP和±dP/dtmax絕對(duì)值明顯升高(P<0.05)，LVEDP明顯降低(P<0.01)，LD組LVEDP明顯降低(P<0.01)，LVSP和±dP/dtmax變化均不明顯；同LD組相比，MD、HD及DIX組大鼠LVSP和±dP/dtmax絕對(duì)值明顯升高(P<0.05，P<0.01)，LVEDP明顯降低(P<0.01，表1)。

Tab.

HR：Heart rate； LVSP： Left ventricular systolic pressure； LVEDP： Left ventricular end diastolic pressure； ±dP/dtmax： Maximal rise/fall velocity of left ventricular pressure； NC： Normal control group; CHF: Chronic heart failure group; LD: Low does group; MD: Middle dose group; HD: High dose group; DIG: Digoxin group

**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsCHF group;△P<0.05，△△P<0.01vsLD group

2.2 大鼠血漿中BNP、cTnI、TNF-α和IL-6含量及心臟重量/體重(HW/BW)比值的組間變化

同NC組相比，其余組大鼠血漿中BNP、TNF-α及IL-6含量均增加(P<0.05，P<0.01)，大鼠血漿中cTnI含量在CHF、LD及MD組高于NC組(P<0.01)，HD與DIG組與之差異不明顯；與CHF組相比，MD、HD及DIG組大鼠血漿中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量均減小(P<0.01)，LD組變化不明顯；BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量在MD、HD和DIG組較LD組顯著減小(P<0.05，P<0.01)；HD和DIG組大鼠顯著低于MD組(P<0.05，P<0.01)；與NC組相比，CHF和LD組大鼠HW/BW顯著增大(P<0.05)，其余各組變化不明顯；與CHF組相比，HD和DIG組顯著減小(P<0.05,P<0.01)，LD和MD組與之差異不明顯。與LD組相比，HD和DIG組大鼠HW/BW顯著減小(P<0.05,P<0.01，表2)。

2.4 各組大鼠心肌通過(guò)HE染色觀察形態(tài)學(xué)變化

心肌HE染色可見(jiàn)：NC組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，無(wú)心肌纖維的破壞，間質(zhì)無(wú)明顯增生(圖1A)；CHF組心肌細(xì)胞受損，心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維溶解斷裂，心肌細(xì)胞間隙明顯增寬(圖1B)；各TFP組情況較CHF組改善，且隨著TFP劑量的增加，有漸好趨勢(shì)(圖1C、D、E)；DIG組心肌纖維排列不規(guī)整，心肌細(xì)胞微腫脹(圖1F，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。

Tab.

BNP： Brain natriuretic peptide; cTnI： Cardiac troponin I; TNF-α： Tumor necrosis factor-α; IL-6： Interleukin-6

*P<0.05，**P<0.01vsNC group;#P<0.05，##P<0.01vsCHF group;△P<0.05，△△P<0.01vsLD group；▲P<0.05，▲▲P<0.01vsMD group

2.5 Masson染色心肌膠原纖維結(jié)果

Masson染色下心肌細(xì)胞呈紅色，膠原呈藍(lán)色。Masson染色結(jié)果顯示：NC組無(wú)明顯膠原沉積(圖2A)；CHF組有較多藍(lán)色心肌膠原沉積于心肌細(xì)胞周?chē)?圖2B，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)，心肌細(xì)胞膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)為(17.18±4.49)%明顯高于NC組(5.57±3.57)%(P<0.01)，LD、MD、DIG組CVF%分別為(15.56±4.40)、(11.19±2.60)、(11.55±2.94)均明顯高于NC組(P<0.01)，HD組CVF為(7.10±1.83)%與NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CHF組相比，MD、HD、DIG組CVF明顯減小(P<0.01，圖3)。

2.6 Tunel法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡

Tunel染色下正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色。Tunel染色結(jié)果可見(jiàn)：NC組心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性染色很少(圖4A)，CHF組大鼠心肌細(xì)胞Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞核顯著增多(圖4B，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅰ)。與NC組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)(1.12±0.24)相比，CHF、LD、MD、HD、DIG各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)分別為(22.61±3.39)、(15.79±2.80)、(9.28±2.10)、(4.73±1.14)、(7.26±1.43)明顯高于NC組(P<0.01)；LD、MD、HD、DIG組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)均低于CHF組(P<0.01)；MD、HD、DIG組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)低于LD組(P<0.01)，且HD低于MD組(P<0.01，圖5)。

2.7 Western blot法檢測(cè)各組大鼠左心室P-Cx43表達(dá)結(jié)果

P-Cx43條帶在分子量43kD處清晰表達(dá)(圖6)。與NC組相比，CHF組P-Cx43條帶明顯增粗，給予TFP灌胃后，隨著TFP劑量的增加，TFP各組P-Cx43條帶逐漸變細(xì)變淡，DIG組P-Cx43條帶較NC處粗，較CHF組變細(xì)。進(jìn)一步半定量分析顯示，與NC組相比，各組中P-Cx43表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與CHF組相比，TFP各組P-Cx43表達(dá)量均降低(P<0.05,P<0.01)，DIG組P-Cx43表達(dá)量較CHF組顯著降低(P<0.01)；MD組P-Cx43表達(dá)量低于LD組(P<0.01)，但高于HD組(P<0.05)，與LD組相比，MD、HD及DIG組P-Cx43表達(dá)量明顯減少(P<0.05,P<0.01)。

2.8 大鼠心肌細(xì)胞P-Cx43表達(dá)水平與凋亡程度的相關(guān)性分析

Pearson直線(xiàn)相關(guān)分析顯示，P-Cx43/GAPDH吸光度值與心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈明顯的正相關(guān)(P<0.01，圖7)。

Fig. 7 Optical density ratio (P-Cx43/GAPDH) and myocardial apoptotic index were positively correlated

3 討論

慢性心力衰竭是常見(jiàn)的危重癥之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究認(rèn)為與心室重構(gòu)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、各種體液因子等有關(guān)[15-17]，尋求防治CHF的方法是目前亟待解決的課題。

蜂膠的主要有效成分是蜂膠總黃酮，具有舒張血管、清除血管內(nèi)壁積存物、改善血管彈性和滲透性，增強(qiáng)心肌收縮力，抑制血小板積聚等作用[18]。有關(guān)蜂膠對(duì)阿霉素所致大鼠慢性心力衰竭的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射阿霉素誘導(dǎo)復(fù)制大鼠CHF模型[12]，通過(guò)蜂膠總黃酮灌胃對(duì)大鼠給藥，旨在探討其對(duì)慢性心衰大鼠的作用及其可能作用機(jī)制。

BNP是由左心室心肌細(xì)胞分泌的一種肽類(lèi)激素，當(dāng)出現(xiàn)心功能衰竭時(shí)，血漿腦鈉肽水平明顯升高[19]。心肌肌鈣蛋白(cTn)廣泛分布于心肌與骨骼肌中，有三種不同的亞單位：cTnI、cTnT和cTnC，分別由不同的基因編碼，有不同的結(jié)構(gòu)和作用，而cTnI是心肌細(xì)胞特有的亞型，具有高度的心肌特異性，故cTnI是一種高靈敏度、高特異性的心肌損傷的標(biāo)志物[20]。腫瘤壞死因子(TNF-α)在CHF病理生理過(guò)程和發(fā)病機(jī)制中起重要的作用，TNF-α可作為CHF發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，在心衰過(guò)程中，其可能參與諸如心肌抑制、血管擴(kuò)張、促進(jìn)左室重構(gòu)及心肌纖維化等病理進(jìn)程[21]。IL-6在CHF患者血中表達(dá)增加，與CHF嚴(yán)重程度緊密相關(guān)[22]。細(xì)胞凋亡是在基因調(diào)控下的細(xì)胞主動(dòng)死亡，因此又稱(chēng)為程序化細(xì)胞死亡。Caspase家族是參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行凋亡最重要的蛋白酶之一，Caspase 3是其家族中最重要的成員，是控制細(xì)胞凋亡發(fā)生及發(fā)展的標(biāo)志酶[23]。文獻(xiàn)報(bào)道，心肌細(xì)胞凋亡的增加與CHF的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)[24]。已有研究表明，CHF時(shí)磷酸化的P-Cx43的含量是升高的[5]，心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白43(Cx43)磷酸化與去磷酸化的水平調(diào)控，在心肌細(xì)胞中的電耦聯(lián)及化學(xué)信息交流中起著非常重要的作用。

心功能指標(biāo)LVSP及+dp/dtmax反映心肌收縮功能，其值越大表明心肌收縮功能越好，-dp/dtmax反映心肌舒張功能，其絕對(duì)值越大，心肌舒張功能越好，LVEDP是反應(yīng)心室泵血過(guò)程中的前負(fù)荷，在正常范圍內(nèi)，其值越低，反應(yīng)心肌舒張功能越好[25]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHF組大鼠心肌收縮及舒張功能明顯低下，LVSP及±dp/dtmax絕對(duì)值明顯降低，LVEDP明顯升高，血漿中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量也明顯增高，HW/BW比值明顯增大，心肌HE及Masson染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞受損明顯，心肌細(xì)胞膠原容積分?jǐn)?shù)顯著增高，心肌細(xì)胞Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞核亦顯著增多；左室肌P-Cx43表達(dá)增多與心肌細(xì)胞凋亡呈明顯的正相關(guān)，同NC組大鼠相比有顯著性差異；而同CHF組相比，MD、HD及DIG組大鼠心臟LVSP及±dp/dtmax絕對(duì)值升高明顯，LVEDP降低明顯，血漿中BNP、cTnI、TNF-α及IL-6含量亦顯著降低，HW/BW比值降低明顯，HE及Masson染色亦表明，心肌細(xì)胞損傷減輕，心肌細(xì)胞膠原容積分?jǐn)?shù)降低，心肌細(xì)胞Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞核亦顯著減少，左室肌P-Cx43表達(dá)減少與心肌細(xì)胞凋亡具有一致性，差異有顯著性。

綜上所述，TFP呈劑量依賴(lài)性改善慢性心衰大鼠的心功能，抑制心室重構(gòu)、減輕心肌細(xì)胞纖維化，對(duì)阿霉素心肌損傷具有明顯的保護(hù)作用，減輕心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與Cx43表達(dá)調(diào)控特別是磷酸化狀態(tài)的調(diào)控密切相關(guān)。

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Effects of total flavonoids of propolis on apoptosis of myocardial cells of chronic heart failure and its possible mechanism in rats

WANG Hai-hua△, ZENG Jin, WANG Hai-zhen, JIANG Yu-xin, WANG Jing, ZHOU Ping-ping

(Department of Physiology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To investigate the effects of total flavonoids of propolis(TFP) on apoptosis of myocardial cells of chronic heart failure and its possible mechanism in rats. Methods: Six male SD rats were randomly selected as normal control group,the remaining rats were made as chronic heart failure (CHF) model by intraperitoneal injection of adriamycin. The rats in the successful model were randomly divided into five groups (n=6): CHF group, total flavonoids of propolis low dose group(LD group), total flavonoids of propolis middle dose group(MD group), total flavonoids of propolis high dose group(HD group),digoxin group(DIG group).After six week treatment, cardiac function indexes of rats were recorded by signal acquisition system;brain natriuretic peptide(BNP),cardiac troponin I(cTnI),tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6(IL-6) content in plasma were detected; Myocardial morphological changes and collagen fiber hyperplasia by HE and Masson staining were observed; Myocardial apoptosis was detected with TUNEL method and protein connexin 43(P-Cx43) expression was detected by Western blot method. Results: Compared with NC group, left ventricular systolic pressure(LVSP) and maximal rise/fall velocity of left ventriculad pressure(±dP/dtmax)absolute value in CHF group were significantly lowered (P<0.01) while left ventricular end diastolic pressure(LVEDP) was increased significantly (P<0.01); Contents of plasma BNP,cTnI,TNF-αand IL-6 in the CHF group were significantly improved (P<0.01). Compared with CHF group, LVSP, ±dP/dtmaxabsolute value in MD and HD groups were increased (P<0.05), and LVEDP was significantly lowered (P<0.01); LVEDP in LD group was significantly lowered (P<0.01), changes in LVSP and ±dp/dtmaxabsolue value were not obvious (P>0.05). BNP, cTnI, TNF-α and IL-6 contents in MD and HD groups were significantly reduced(P<0.01), but those plasma indicator changes were not obvious in LD group(P>0.05). Western blot showed that P-Cx43 expression in CHF group was significantly higher than that in NC group(P<0.01)and that in all TFP treatment groups it was decreased compared with CHF group(P<0.05,P<0.01),among which pairwise comparisons also showed differences (P<0.05),myocardial apoptosis index (%)(22.62±3.39) in CHF group was higher than that in NC group(1.12±0.24)(P<0.01);compared with CHF group,the apoptosis index of myocardial cells (%) in LD,MD and HD groups, (15.79+2.8),(9.28+2.1) and (4.73+1.14)respectively, were significantly lower than those in the CHF group(P<0.01). The expression level of P-Cx43 positively correlated with the apoptotic index (r=0.861,P<0.01). Conclusion: Total flavonaids of propolis have inhibitory effect on apoptosis of myocardial cells of chronic heart failure induced by adriamycin in rats, and the mechanism may be closely related to the regulation of Cx43 expression, especially the regulatory phosphorylation status.

chronic heart failure; total flavonaids of propolis; gap junction channel; connexin 43; rats

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81172790)；安徽省高校省級(jí)科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2013A251)；安徽省2012年省級(jí)教學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(2012jyxm313)

2014-12-05

2015-02-11

R73-3

A

1000-6834(2015)03-201-06

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.003

△【通訊作者】Tel： 13675536187； E-mail: wanghaihua9972@sina.com