楊碩，陳靜，胡琦，江洪

論著·基礎(chǔ)

miR-17表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激作用的影響

楊碩，陳靜，胡琦，江洪

目的 探討microRNA-17(miR-17)表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激作用的影響。方法 培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒[Ad(N)組]、上調(diào)miR-17腺病毒(Ad-Pre-miR-17組)及下調(diào)miR-17腺病毒(Ad-Antagomir-17組)，用硝酸銀法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性NO的釋放，DAF FM探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO含量，以及采用DHE探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物(ROS)的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 與Ad(N)組比較，Ad-Antagomir-17組細(xì)胞內(nèi)NO含量提高(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量降低(P<0.05)；而Ad-Pre-miR-17組細(xì)胞內(nèi)NO含量降低(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加(P<0.05)。結(jié)論 降低miR-17可以改善冠心病患者血流供應(yīng)，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，有助于其血管功能的改善。

miR-17；內(nèi)皮細(xì)胞；一氧化氮；氧化應(yīng)激

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(PCI)是冠心病治療的重要手段，術(shù)后主要問題是容易出現(xiàn)支架內(nèi)再狹窄和晚期支架內(nèi)血栓[1，2]，可以導(dǎo)致再次血運(yùn)重建及心臟不良事件發(fā)生率明顯升高[3，4]。研究證實(shí)內(nèi)皮損傷修復(fù)延遲是其共同的病理生理基礎(chǔ)[5，6]，促使損傷部位早期形成功能完全的完整內(nèi)皮層對(duì)于提高PCI 的有效性和安全性都具有重要意義。

microRNA 是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長(zhǎng)約20～25 個(gè)核苷酸，成熟的microRNA 通過2 種途徑負(fù)向調(diào)節(jié)基因表達(dá)，即在翻譯水平上阻止蛋白合成和引起目的基因mRNA 的剪切降解[7]。有研究表明miR-17在內(nèi)皮細(xì)胞(EC)中含量非常豐富[8]，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-17 具有抗血管形成的能力，抑制其表達(dá)可提高內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成密度[9，10]。由此我們推斷，對(duì)于損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞，miR-17過表達(dá)可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)延遲。現(xiàn)從氧化應(yīng)激方面闡述miR-17對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購(gòu)買于美國(guó)Sciencell公司(Cat:8000)，內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基(ECM)(美國(guó)Sciencell公司)，DAF FM探針及DHE探針購(gòu)買于美國(guó)invitrogen公司，NO試劑盒購(gòu)買于南京建成公司。

1.2 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 原代HUVEC用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基(ECM)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有5%胎牛血清(FBS)，1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGS)以及1%雙抗。每2天換一次液，細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)用胰酶消化傳代，傳至4～6代時(shí)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 病毒轉(zhuǎn)染：委托上海吉?jiǎng)P公司成功構(gòu)建攜帶miR-17表達(dá)序列的腺病毒(Ad-Pre-miR-17)，用于上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-17的表達(dá)水平；同時(shí)構(gòu)建攜帶miR-17反義序列的腺病毒(Ad-Antagomir-17)，用于抑制miR-17的活性，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-17的含量；用含有相同基因片段，但不對(duì)體內(nèi)microRNA產(chǎn)生干擾的腺病毒[Ad(N)]作為陰性對(duì)照。上述培養(yǎng)細(xì)胞，融合達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化計(jì)數(shù)，種于直徑60 mm的小皿之中，每皿調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為6×105個(gè)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使之貼壁。用不含血清及生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基同步化24 h后，分別按感染復(fù)數(shù)MOI=15/20/30/40轉(zhuǎn)入上述3組腺病毒，分為Ad-Pre-miR-17組、Ad-Antagomir-17組以及Ad(N)組。在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，去除含病毒的培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 觀測(cè)項(xiàng)目

1.4.1 一氧化氮(NO)測(cè)定：(1)硝酸銀法測(cè)細(xì)胞內(nèi)源性NO釋放：收集上述轉(zhuǎn)染病毒72 h后的細(xì)胞培養(yǎng)液，用南京建成公司的NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)上清液中的NO含量，具體做法參照說明書進(jìn)行。(2)DAF-FM探針測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO含量：用DAF FM探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO的含量。將上述轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞分別消化計(jì)數(shù)，種于24孔板中，每孔調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為105，過夜使之貼壁，吸去原有培養(yǎng)基，加入含有DAF-FM的無血清培養(yǎng)基5 μmol/ml，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，每孔隨機(jī)拍取6張照片，取平均熒光強(qiáng)度。

1.4.2 ROS熒光探針-DHE探針測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平：用DHE探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物(ROS)的含量。將上述轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞分別消化計(jì)數(shù)，種于24孔板中，每孔調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為105，過夜使之貼壁，吸去原有培養(yǎng)基，加入含有DHE(10 μmol/ml)的無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，每孔隨機(jī)拍攝6張照片，取平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 病毒轉(zhuǎn)染效率 熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)算綠色熒光細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，計(jì)算得出在MOI=30時(shí)轉(zhuǎn)染效率較高并且細(xì)胞狀態(tài)較好，漂浮細(xì)胞數(shù)少。Ad-Antagomir-17組轉(zhuǎn)染效率為81.2%，Ad(N)組轉(zhuǎn)染效率為79.8%，Ad-Pre-miR-17組轉(zhuǎn)染效率為80.6%，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1(見封3)。

2.2 miR-17對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(NO)的影響

2.2.1 硝酸銀法檢測(cè)結(jié)果：下調(diào)miR-17可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性NO的釋放，Ad(N)組NO釋放量為(113.0±3.1)μmol/L，Ad-Antagomir-17組NO釋放量為(138.7±4.2) μmol/L，比Ad(N)組增加了(22.7±5.236)%；相反，上調(diào)miR-17可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)源性NO 的釋放，Ad-Pre-miR-17組NO釋放量為(35.23±1.0) μmol/L，比Ad(N)組下降了(68.8±3.3)%，2組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2A。

2.2.2 DAF-FM探針檢測(cè)結(jié)果：下調(diào)miR-17可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO 的產(chǎn)生，Ad(N)組DAF-FM平均熒光強(qiáng)度為28.3 ± 1.7，Ad-Antagomir-17組DAF-FM平均熒光強(qiáng)度為44.4 ± 2.1，比Ad(N)組增加了(57.0±2.8)%；相反，上調(diào)miR-17可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NO 的產(chǎn)生，Ad-Pre-miR-17組DAF-FM平均熒光強(qiáng)度為18.3 ± 1.3，比Ad(N)組下降了(35.3±2.1)%，2組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2B，圖3(見封3)。

2.3 miR-17對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)超氧化物(ROS)含量的影響 下調(diào)miR-17可以降低內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，Ad(N)組DHE平均熒光強(qiáng)度為28.3 ± 1.7，Ad-Antagomir-17組DHE平均熒光強(qiáng)度為18.0 ± 1.4，與Ad(N)組相比降低了(36.5±2.2)%，而上調(diào)miR-17則可以使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)超氧化物含量增加，Ad-Pre-miR-17組DHE平均熒光強(qiáng)度為45.5 ± 3.7，與Ad(N)組相比增加了(60.8±4.2)%(P<0.05)。DHE探針檢測(cè)結(jié)果見圖4，圖5(見封3)。

2 討 論

目前已發(fā)現(xiàn)miR-17在腫瘤組織中具有抗血管形成的能力，下調(diào)miR-17還可以促進(jìn)糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的成骨細(xì)胞的分化和功能,此外其還與B細(xì)胞淋巴瘤、急性自身免疫性疾病等疾病有關(guān)[11～13]。近來研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA與心臟疾病的病理生理過程相關(guān)[14]。但是關(guān)于miR-17與心臟疾病的研究并不多。在大鼠頸總動(dòng)脈損傷修復(fù)過程中，研究提示miR-17 表達(dá)持續(xù)升高；而促血管形成的miR-18a 和miR-19a 表達(dá)無明顯改變，之前還有研究證實(shí)miR-17與腫瘤組織的增殖和凋亡有關(guān)，我們前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR-17可能與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移增殖有關(guān)[15]。由此我們猜測(cè)，miR-17可能與內(nèi)皮細(xì)胞的其他功能如氧化應(yīng)激等有關(guān)。

注：與Ad(N)組比較，aP<0.05

注：與Ad(N)組比較，aP<0.05

大多數(shù)情況下，內(nèi)皮功能紊亂都是由于體內(nèi)ROS過多導(dǎo)致的。ROS的體內(nèi)生理平衡是由O2-生成酶和抗氧化劑共同決定的[16]。氧化應(yīng)激形成是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)如SOD、GSH-PX、GSH等防御機(jī)能減弱或是體內(nèi)ROS產(chǎn)生過多的結(jié)果[17]，使機(jī)體處于易損狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)ROS可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生物膜脂質(zhì)過氧化，降低膜的流動(dòng)性，增加內(nèi)皮細(xì)胞膜的通透性，引起內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，從而導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血流量下降，加重血管及心肌損傷[18]。ROS還破壞內(nèi)皮細(xì)胞源性一氧化氮合酶和四氫葉酸(一氧化氮合酶的重要輔助因子)的生物活性，導(dǎo)致NO合成減少[19]。此外，ROS還可以激活轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，進(jìn)而加重白細(xì)胞聚集，微血管阻塞。此外，ROS抑制細(xì)胞Na+-K+-ATP酶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而進(jìn)一步導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血流量減少[20]。NO不但可以使血管舒張，阻止血小板聚集，抑制黏附分子(CD11/CD18)表達(dá)[21]。因此，NO合成減少可引起冠狀動(dòng)脈血管收縮，血小板黏附、聚集形成微血栓，白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷增強(qiáng)，從而加重血管損傷并延遲其修復(fù)。

研究證實(shí)，氧化應(yīng)激與多條通路有關(guān)，比如STAR、p38MAPK、PI3K/AKT、MEK/ERK等[22]。與內(nèi)皮相關(guān)的通路大多為PI3K/AKT通路和MEK/ERK通路，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-17對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ROS及NO具有調(diào)節(jié)作用，是否通過上述通路亦或者是通過多條通路共同作用目前尚不清楚，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，下調(diào)miR -17對(duì)冠心病患者具有保護(hù)作用，而上調(diào)miR-17則作用相反。miR-17對(duì)冠心病患者血流供應(yīng)的改變究竟只是通過氧化應(yīng)激的作用還是通過對(duì)損傷血管的修復(fù)作用，還有待進(jìn)一步的研究，而其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用機(jī)制目前亦尚不明確，還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。

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The effect of microRNA-17 expression on oxidative stress in endothelial cells

YANGShuo,CHENJing,HUQi,JIANGHong.DepartmentofCardiology,RenminHospital,WuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:JIANGHong,E-mail:phyhongj@163.com

Objective To investigate the effect of microRNA-17 (miR-17) expression on endothelial cell oxidative stress.Methods Cultured original generation umbilical vein endothelial cells (HUVEC), they were transfected to negative control virus [Ad(N) group], up-regulation of miR-17 adenovirus (Ad-Pre-miR-17) and down-regulation of miR-17 adenovirus (Ad-Antagomir-17 group), the release of endogenous nitric oxide (NO) is detected by the silver nitrate method, the content of NO in DAF FM probe for the detection of cell, and used DHE probe for the detection of cell super oxide (ROS) content and analyzed.Results Compared to Ad (N) group, the content of NO in Ad-Antagomir-17 cell group increased (P<0.05), intracellular ROS content decreased (P<0.05); and reduce the content of NO in Ad-pre-miR-17 cells (P<0.05), intracellular ROS increased (P<0.05). Conclusion Reduce miR-17 can improve blood supply in patients with coronary heart disease, reduce oxidative stress and help to improve vascular function.

MicroRNA-17; Endothelial cells; Nitric oxide ; Oxidative stress

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81170195；81200156)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科

江洪，E-mail:phy-hongj@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.11.023

2015-04-23)