陳軍童 茍 蓉 邢玉榮 王劉偉 王瑞強(qiáng) 唐 琳

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腎損傷分子1對(duì)高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞自噬作用的影響

陳軍童1茍 蓉1邢玉榮2王劉偉1王瑞強(qiáng)1唐 琳1

目的：研究腎損傷分子1(KIM-1)與高糖環(huán)境下人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)自噬的關(guān)系，探討KIM-1參與糖尿病腎病進(jìn)展的可能機(jī)制。 方法：體外培養(yǎng)HK-2分五組:(1)對(duì)照組(D-葡萄糖5.6 mmol/L)；(2)高滲組(D-葡萄糖5.6 mmol/L+D-甘露醇24.4 mmol/L)；(3)高糖組(D-葡萄糖30 mmol/L)；(4)高糖+KIM-1 siRNA組；(5)高糖+siRNA對(duì)照組。分別于培養(yǎng)8h、16h、24h進(jìn)行測(cè)定。Western印跡法檢測(cè)細(xì)胞KIM-1、自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白l輕鏈3II型(LC3II)蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR法(real-time PCR)法檢測(cè)細(xì)胞KIM-1、LC3II mRNA的表達(dá)。透射電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，高糖組細(xì)胞KIM-1、LC3II蛋白及mRNA表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加(P<0.05)，細(xì)胞內(nèi)自噬體形成數(shù)量呈時(shí)間依賴性增多(P<0.05)。與高糖組相比，KIM-1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞KIM-1、LC3II蛋白及mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.05)，自噬體形成數(shù)量減少(P<0.05)。 結(jié)論：下調(diào)KIM-1的表達(dá)能顯著抑制高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞LC3II的表達(dá)和自噬體的形成，提示KIM-1可能通過(guò)調(diào)控高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞自噬參與糖尿病腎病的進(jìn)展。

糖尿病腎病 腎小管上皮細(xì)胞 腎損傷分子1 自噬

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，以進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化(RIF)為特征，為導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的重要原因之一。自噬是細(xì)胞維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種方式，研究表明，細(xì)胞自噬增加可促進(jìn)RIF的進(jìn)展[1-3]。腎損傷分子1(KIM-1)是由受損近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜糖蛋白，在急性腎損傷(AKI)時(shí)可促使腎小管上皮細(xì)胞向“半專業(yè)”吞噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞的自噬功能[4-6]；在包括DN在內(nèi)的多種慢性腎臟病(CKD)中，KIM-1與RIF程度呈正相關(guān)[7]。目前尚不明確，KIM-1是否對(duì)糖尿病腎病(DN)的細(xì)胞自噬作用具有調(diào)控，并參與疾病進(jìn)展。本研究采用體外高糖培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，觀察KIM-1、自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ型(LC3Ⅱ)的蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)情況，并在透射電鏡下觀察細(xì)胞自噬體的形成，以及經(jīng)KIM-1 siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)上述指標(biāo)的影響，旨在探討KIM-1參與DN進(jìn)展的可能機(jī)制。

材料與方法

材料 HK-2(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，小鼠抗人KIM-1單克隆抗體(美國(guó)Abcam)，兔抗人LC3Ⅱ多克隆抗體(美國(guó)Abcam)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗兔二抗、抗鼠二抗(北京中杉金橋)，KIM-1 siRNA(上海吉瑪)，Lipofectamine 2000(美國(guó)Invitrogen)，胎牛血清(BI 以色列)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone)。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組 HK-2于含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中(D-葡萄糖5．6 mmol/L)37℃，5%C02貼壁培養(yǎng)，以0.25%胰酶消化，1∶3傳代，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h后隨機(jī)分為5組：(1)對(duì)照組(D-葡萄糖5.6 mmol/L)；(2)高滲組(D-葡萄糖5.6 mm01/L +D-甘露醇24.4 mmol/L)；(3)高糖組(D-葡萄糖30 mmol/L)；(4)高糖+KIM-1 siRNA組；(5)高糖+siRNA對(duì)照組。分別于8h、16h、24h各時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 細(xì)胞接種于12孔板中，2×105個(gè)/孔，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好、貼壁率達(dá)70%～80%的細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染KIM-1 siRNA(KIM-1 siRNA由上海吉瑪公司合成，陰性對(duì)照由該公司提供)，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行操作，同時(shí)設(shè)siRNA對(duì)照組。將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱，6 h后改為葡萄糖濃度為30 mmol/L的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。

Western印跡法檢測(cè)KIM-1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá) 常規(guī)收集各組細(xì)胞，按照全細(xì)胞裂解液說(shuō)明書提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。20～40 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h。孵育一抗，加入KIM-1抗體(1∶500)，LC3II抗體(1∶500)，及β-actin抗體(1∶1 000)4℃過(guò)夜。次日TBST漂洗3次，10 min，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔及馬抗小鼠二抗(1∶500)室溫孵育2h，TBST漂洗3次，10 min。DAB顯色、成像。按相同實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。ImageJ軟件分析目的條帶灰度值。

Real Time-PCR法檢測(cè)KIM-1、LC3IImRNA表達(dá) TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外線分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，每個(gè)樣本取總RNA 2 μg，按試劑盒操作說(shuō)明，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。用熒光定量PCR儀分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線，用Ct值表示樣品中模板的相對(duì)含量。反應(yīng)體系：20 μl反應(yīng)體系中加入正、負(fù)引物(10 μmol/L)各1 μl，PCRMaster mix 10 μl，模板1 μl，加DEPC水補(bǔ)足。循環(huán)條件：95℃ 30s，95℃ 5s和60℃ 32s，循環(huán)40次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列：GeneCopoeia公司提供GAPDH (Mm-QRP-20008)KIM-1(Hs-QRP-21461)LC3II(Hs-QRP-48951)。

電鏡觀察自噬體 預(yù)冷PBS清洗各組細(xì)胞，收集細(xì)胞并用2%戊二醛溶液4℃固定2h，1%鋨酸固定1h，70%～100%丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片、染色，透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。每份標(biāo)本相同放大倍數(shù)下隨機(jī)選取10個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行自噬體計(jì)數(shù)。以每視野平均自噬體數(shù)進(jìn)行半定量分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

高糖對(duì)HK2表達(dá)KIM-1及LC3Ⅱ的影響 Western印跡結(jié)果示，正常對(duì)照組及高滲組幾乎無(wú)KIM-1蛋白表達(dá)，與正常對(duì)照組相比，高糖組培養(yǎng)8h、16h、24h后，KIM-1蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；正常對(duì)照組及高滲組LC3II蛋白正常表達(dá)，兩組表達(dá)量無(wú)明顯差異(P>0.05)，與正常對(duì)照組相比，高糖組培養(yǎng)8h、16h、24h后LC3II蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果示，KIM-1 mRNA及LC3Ⅱ mRNA變化趨勢(shì)與蛋白變化趨勢(shì)一致(圖1)。

圖1 不同組細(xì)胞KIM-1和LC3Ⅱ的表達(dá)量變化(A：Western印跡，B：Real-Time PCR)KIM-1：腎損傷分子1；LC3Ⅱ：噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ型；1：正常對(duì)照組 2：高滲對(duì)照組；3：高糖8h組；4：高糖16h組；5：高糖24h組；a：與正常對(duì)照組相比，P<0.05

高糖對(duì)HK-2細(xì)胞自噬體形成的影響 透射電鏡觀察結(jié)果示，對(duì)照組與高滲組細(xì)胞有少量自噬體形成，高糖引起HK-2細(xì)胞自噬體數(shù)量明顯增多，并呈時(shí)間依賴性(P<0.05)(圖2)。

圖2 各組細(xì)胞自噬體(↑)形成情況(EM，×50 000)1:正常對(duì)照組;2:高滲對(duì)照組;3:高糖8h組;4:高糖16h組;5:高糖24h組;與正常對(duì)照組相比,aP<0.05

高糖環(huán)境KIM-1 siRNA的干擾效率 KIM-1 SiRNA轉(zhuǎn)染組和siRNA對(duì)照組經(jīng)高糖處理24h后，Western印跡和Real-Time PCR結(jié)果示，80 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染效率最高，與siRNA對(duì)照組相比，KIM-1 siRNA轉(zhuǎn)染組KIM-1蛋白表達(dá)量下降86.8%，KIM-1mRNA表達(dá)量下降80.6%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 高糖環(huán)境下KIM-1 siRNA的干擾效率(Western印跡和Real-Time PCR)KIM-1：腎損傷分子1；1:siRNA對(duì)照組;2:80 nmol/L KIM-1 siRNA轉(zhuǎn)染組;a：與陰性對(duì)照組相比,P<0.05

KIM-1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)高糖環(huán)境下腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)KIM-1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA含量及細(xì)胞內(nèi)自噬體形成數(shù)量影響 Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組和高滲組相比，高糖組細(xì)胞KIM-1、LC3Ⅱ表達(dá)均明顯增加(P<0.05)；與高糖組相比，KIM-1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞KIM-1、LC3Ⅱ表達(dá)量均明顯下降(P<0.05)。RT-PCR結(jié)果與Western印跡結(jié)果趨勢(shì)一致(圖4)。透射電鏡觀察結(jié)果示，與對(duì)照組和高滲組相比，高糖組細(xì)胞自噬體形成數(shù)量明顯增加。與高糖組相比，KIM-1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞自噬體形成數(shù)量明顯減少(圖5)。

圖4 各組細(xì)胞KIM-1和LC3Ⅱ的表達(dá)量變化(A：Western印跡，B：Real-Time PCR)KIM-1：腎損傷分子1；LC3Ⅱ：自噬標(biāo)志蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3II型； 1：正常對(duì)照組;2：高滲組；3：高糖組；4：KIM-1siRNA轉(zhuǎn)染組；5：siRNA對(duì)照組；a：與正常對(duì)照組相比，P<0.05；b：與高糖組相比，P<0.05

圖5 各組細(xì)胞自噬體(↑)形成(EM，×50 000)1:正常對(duì)照組;2:高滲組;3:高糖組;4:KIM-1 siRNA轉(zhuǎn)染組;5:siRNA對(duì)照組;a：與正常對(duì)照組相比,P<0.05；b：與高糖組相比,P<0.05

討 論

自噬是細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制，通過(guò)對(duì)自身受損細(xì)胞器和老化蛋白等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解并再利用，以維持蛋白代謝平衡及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[8,9]。研究表明自噬也是細(xì)胞的一種死亡方式，一旦啟動(dòng)必須在度過(guò)危機(jī)后適時(shí)停止，否則其特異性捕獲胞質(zhì)成分的特性將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷[10]。LC3II蛋白是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，其始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此LC3Ⅱ的水平與自噬體的數(shù)量成正比[11]。透射電鏡下觀察到自噬體是自噬形成的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。本研究以HK-2為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在體外培養(yǎng)的情況下予以高糖刺激，觀察到在高糖環(huán)境下，LC3II表達(dá)增加，細(xì)胞自噬體產(chǎn)生增多，表明高糖可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞自噬功能增強(qiáng)。

KIM-1是由受損近曲腎小管上皮細(xì)胞分泌的一種跨膜糖蛋白，在正常腎組織中未被檢測(cè)到，但在AKI和CKD中均顯著增加[13-15]。其不僅可作為腎臟損傷的敏感及特異性指標(biāo)，更參與了包括腎小管上皮細(xì)胞的損傷與修復(fù)、細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)等多種病理生理過(guò)程[16]。作為一種磷脂酰絲氨酸受體，其能夠促使腎小管上皮細(xì)胞向“半專業(yè)”吞噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞自噬功能，發(fā)揮清除凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞碎片的作用[4-6]；在慢性損傷導(dǎo)致的CKD中，KIM-1表達(dá)于去分化的近端小管上皮細(xì)胞，與一些腎小管間質(zhì)損傷的標(biāo)志物如骨橋蛋白、α平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)同向表達(dá)[17]；在DN大鼠模型中KIM-1表達(dá)增多，在人的腎組織穿刺活檢標(biāo)本中，也發(fā)現(xiàn)除微小病變外，KIM-1在所有腎臟疾病纖維化區(qū)域的小管中表達(dá)均升高，且與小球病變程度成正比[7]。另外，在Ren2大鼠模型中，KIM-1被發(fā)現(xiàn)與腎素-血管緊張素系統(tǒng)活化導(dǎo)致的腎損傷有關(guān)，阻斷RAS可以降低腎間質(zhì)纖維化，同時(shí)降低KIM-1的表達(dá)[18-19]。因此，在急性損傷的情況下，KIM-1可通過(guò)介導(dǎo)自噬抑制炎癥，幫助組織修復(fù)；而在慢性損傷的情況下，KIM-1很有可能通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞自噬長(zhǎng)期過(guò)度激活，加重慢性腎損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組及高滲組中幾乎無(wú)KIM-1的表達(dá)，高糖培養(yǎng)條件下，腎小管上皮細(xì)胞KIM-1表達(dá)增多，且呈時(shí)間依賴性，說(shuō)明高糖可促進(jìn)KIM-1的表達(dá)。應(yīng)用KIM-1siRNA轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞后，KIM-1蛋白和基因水平均顯著下降，同時(shí)LC3II蛋白和RNA表達(dá)量明顯降低，透射電鏡下細(xì)胞自噬體形成數(shù)量較少，說(shuō)明KIM-1對(duì)細(xì)胞自噬表達(dá)有一定的調(diào)控作用，從而推測(cè)KIM-1可能通過(guò)介導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞自噬參與DN腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。但由于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有刺激因素單一等局限性，不能完全反映糖尿病腎病狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的變化反應(yīng)過(guò)程，故有待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究論證。

本實(shí)驗(yàn)觀察了高糖可刺激腎小管上皮細(xì)胞KIM-1表達(dá)增加及自噬功能增強(qiáng)，這與既往的相關(guān)研究報(bào)道相符。同時(shí)本文證實(shí)高糖環(huán)境下KIM-1可對(duì)腎小管上皮細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而有可能通過(guò)該作用參與DN的進(jìn)展。本研究為進(jìn)一步探討DN的發(fā)展機(jī)制提供了新思路。

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(本文編輯 律 舟)

Effects of KIM-1 on high glucose induced the autophagy in human tubular epithelial cells

CHENJuntong1,GOURong1,XINGYurong2,WANGLiuwei1,WANGRuiqiang1,TANGLin1

1DepartmentofNephrology,NephrologyResearchInstituteofZhengzhouUniversityInstituteofClinicalMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China2Physicalcentre,ThefirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China

TANGLin(E-mail：tanglin@zzu.edu.cn)

Objective：To research the effects of Kidney Injury Molecule 1(KIM-1)on high glucose induced the autophagy in human tubular epithelial cells (HK2) and to explore the possible mechanisms of KIM-1 involved in the progress of diabetic nephropathy (DN). Methodology：HK2 were cultured in vitro and divided into different groups. They were (1) Normal control Group (D-glucose 5.6 mmol/L); (2) Hypertonic group (D-glucose 5.6 mmol/L+D-mannitol 24.4 mmol/L); (3) High glucose group (D-glucose 30 mmol/L); (4) KIM-1 siRNA group; and (5) Control siRNA group. The corresponding indexes were measured at 8th, 16th and 24th hours. Western blotting was used to detect the protein expression of KIM-1 and autophagy protein microtubule-associated protein 1 light chain 3II(LC3II). Real Time-PCR was used to detect mRNA expression of KIM-1 and LC3II. The autophagosomes formed in human tubular epithelial cells were observed by transmission electron microscope (TEM). Results：Compared with the control group, the protein and mRNA expression of KIM-1 and LC3II in the high glucose group were increased (P<0.05), and the number of autophagosomes were also added in a time-dependent manner (P<0.05). Compared with the high glucose group, the protein and mRNA expressions of KIM-1 and LC3II were decreased (P<0.05), and the number of autophagosomes were reduced in KIM-1 siRNA group (P<0.05). Conclusion：Down-regulating the expression of KIM-1 can inhibit the expression of LC3II and the formation of autophagosomes, which suggests that KIM-1 may be involved in the progress of DN by regulating the autophagy in human tubular epithelial cells.

Diabetic nephropathy renal tubular epithelial cell Kidney injury factor-1 Autophagy

國(guó)家自然科學(xué)基金(81300605)

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科 鄭州大學(xué)腎臟病研究所 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室(鄭州，450052)；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心

唐 琳(E-mail:tanglin@zzu.edu.cn)

2014-11-22

? 2015年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有