田 磊 徐維佳 張 珍 邵興華 謝園園 王 琴 王 玲 車霞靜 倪兆慧 牟 姍

?

黃芪甲苷抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

田 磊1*徐維佳2*張 珍1邵興華1謝園園1王 琴1王 玲1車霞靜1倪兆慧1牟 姍1

目的：探討黃芪甲苷(AS-IV)抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 方法：體外采用TGF-β1(10 ng/ml)刺激人近端小管上皮細(xì)胞(HK-2)，采用不同濃度的AS-IV(50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml)進(jìn)行干預(yù)治療24h收集細(xì)胞。體內(nèi)建立小鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型，C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UUO組)和治療組(AS-IV組)。采用單側(cè)(右)輸尿管結(jié)扎建立UUO模型，Sham組僅游離輸尿管但不結(jié)扎，AS-IV組連續(xù)7天給予AS-IV[20 mg/(kg·d)]灌胃，UUO組和Sham給予等劑量溶劑灌胃，術(shù)后第14天采集腎臟組織。TUNEL法檢測凋亡，CCK法觀察細(xì)胞活性，Western印跡檢測TGF-β1和被切割的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase 3)表達(dá)，并觀察c-Jun氨基末端激酶(JNK)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化情況。 結(jié)果：AS-IV改善UUO誘導(dǎo)的腎組織TGF-β1表達(dá)及細(xì)胞凋亡(P<0.01)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活性下降及細(xì)胞凋亡，200 μg/ml AS-IV作用最明顯(P<0.01)。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均可見，AS-IV減少caspase 3活化，抑制JNK MAPK磷酸化。 結(jié)論：AS-IV可抑制TGF-β1的表達(dá)及其誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與JNK MAPK通路有關(guān)。

黃芪甲苷 轉(zhuǎn)化生長因子β1 細(xì)胞凋亡 c-Jun氨基末端激酶

慢性腎臟病(CKD)是常見病，我國總體患病率為10.8%[1]。CKD進(jìn)展所致終末期腎病(ESRD)是危害人類健康、消耗大量衛(wèi)生資源的重大慢性病，給我國公共衛(wèi)生事業(yè)帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。腎纖維化是CKD進(jìn)展的重要特征，腎小管上皮細(xì)胞的凋亡是腎纖維化發(fā)生的主要機(jī)制之一[2]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是參與腎纖維化的重要細(xì)胞因子[3]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，TGF-β1通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡參與腎臟纖維化[4]。盡管腎纖維化的部分機(jī)制已明確，但臨床尚無療效確切的抗腎纖維化藥物。中藥黃芪具有補(bǔ)氣、固表、扶正、祛邪的功效，能夠治療腎臟疾病，但其防治腎臟病的機(jī)制并不明確。近期我們的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)[5]，黃芪的有效組分黃芪甲苷(AS-IV)通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路改善高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。AS-IV在TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用，目前研究較少。本研究通過體外TGF-β1刺激腎小管上皮細(xì)胞和體內(nèi)建立單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)小鼠模型，闡述AS-IV對TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，并初步探討可能的分子機(jī)制。

材料和方法

主要材料 人近端小管上皮細(xì)胞株(HK-2)(美國ATCC)；C57BL/6 小鼠(上海市斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；黃芪甲苷(純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所)；重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1(CN100-21，美國PeproTech)；兔抗小鼠和人GAPDH、TGF-β1、被切割的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspased 3)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、JNK磷酸 化 蛋 白(p-JNK)單 克 隆 抗 體(美 國Cell Signaling )；細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；ECL Western Blotting Substrate試劑盒(美國Pierce公司)；TUNEL檢測試劑盒(美國Promega)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 (CCK8)(上海碧云天)；OCT包埋劑(Sakura公司)；聚偏二氟乙烯膜(美國Millipore公司)。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)和分組 HK-2 細(xì)胞株采用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國gibco)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)、傳代。采用不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基同步24h，進(jìn)行分組：(1)正常組：正常培養(yǎng)基添加等量溶劑；(2)TGF-β1組：10 ng/ml 的TGF-β1刺激細(xì)胞；(3)AS-IV組：在TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞同時(shí)，分別添加不同劑量(50、100、200 μg/ml)AS-IV進(jìn)行藥物干預(yù)。各組刺激24h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后序?qū)嶒?yàn)。

動(dòng)物模型制備和分組 雄性C57BL/6 小鼠28只，8 周齡，體質(zhì)量(20±2)g，無特定病原體(SPF)級(jí)，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為3 組：假手術(shù)組(Sham組，n=8)，模型組(UUO組，n=10)，治療組(AS-IV組，n=10)。UUO組及AS-IV組小鼠接受單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，Sham組僅游離輸尿管、不結(jié)扎。具體方法如下：3.5%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，行背部右肋下切口，暴露并分離右側(cè)輸尿管，用6-0縫線行兩次結(jié)扎。AS-IV組從術(shù)后0.5h開始，給予AS-IV[20 mg/(kg·d)]灌胃，連續(xù)7d。Sham和UUO組給予等體積溶劑灌胃。術(shù)后第14天處死，收集梗阻側(cè)腎組織待檢。

CCK-8實(shí)驗(yàn) 按照CCK-8 檢測試劑盒說明書操作。簡述如下：HK-2細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞/孔密度接種在96孔板，不同藥物刺激24h后每孔加入10 μl CCK-8檢測試劑，37℃ 孵育1h，于450 nm波長處讀取吸光度A 值。

Western印跡檢測腎組織和HK-2細(xì)胞中蛋白表達(dá) 提取各組織及細(xì)胞蛋白，根據(jù)目的蛋白分子量大小制備所需濃度的SDS-PAGE 膠。各組蛋白上樣后行SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。采用70伏恒壓進(jìn)行電泳，250毫安恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間控制在1.5～2h。5%脫脂奶粉封閉1 h 后分別用兔抗小鼠和人TGF-β1、GAPDH、cleaved-caspase 3、JNK、p-JNK抗體(稀釋度1∶1 000)4℃孵育過夜，洗膜后結(jié)合辣根過氧化物酶(HRP )標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5 000 TBST稀釋)室溫孵育1h，ECL 發(fā)光顯影試劑反應(yīng)后，采用Western印跡自動(dòng)成像儀掃描并獲得顯影圖像。

TUNEL染色檢測凋亡 通過體外制作HK-2細(xì)胞爬片和體內(nèi)小鼠腎臟組織冰凍切片進(jìn)行TUNEL染色。簡述步驟如下：細(xì)胞爬片和組織切片依次經(jīng)4%多聚甲醛和0.1%Triton X-100固定和通透后，每個(gè)樣品加入50 μl TUNEL反應(yīng)液(反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用)，37℃濕盒中孵育60 min(注意避光)，磷酸鹽緩沖液洗片后加入封片劑(含DAPI和抗淬滅劑)封片，最后熒光顯微鏡記錄熒光圖像。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均值比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

AS-IV對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞活性和形態(tài)的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示(圖1A)，TGF-β1 刺激組細(xì)胞活性較正常組明顯下降(P<0.01),AS-IV干預(yù)組細(xì)胞活性較TGF-β1 刺激組增強(qiáng)，200 mg/ml AS-IV作用效果最好(P<0.01)。在光鏡下觀察HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變(圖1B)，可見正常對照組中HK-2細(xì)胞形態(tài)清楚，呈鵝卵石樣，細(xì)胞銜接緊密，貼壁良好，少見漂浮細(xì)胞。TGF-β1 刺激24h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，呈梭形或形態(tài)多樣無規(guī)則，細(xì)胞排列稀疏，生長緩慢，貼壁差，多見漂浮細(xì)胞。200 μg/ml AS-IV干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)較TGF-β1組形態(tài)顯著改善，貼壁尚可，漂浮細(xì)胞明顯減少。

圖1 AS-IV對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)和活性的影響AS-IV：黃芪甲苷；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1；A：CCK檢測細(xì)胞活性結(jié)果；B：顯微鏡下HK-2細(xì)胞形態(tài)改變；**：與對照組比較，P<0.01；##：與TGF-β1組比較，P<0.01；#：與TGF-β1組比較，P<0.05

AS-IV對 TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 Western 印跡結(jié)果顯示，TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞24h后，可見cleaved-caspase 3表達(dá)明顯升高(P<0.01)，依次加入不同濃度的AS-IV干預(yù)后，cleaved-caspase 3表達(dá)減少，且隨著AS-IV濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)(P<0.01)。TUNEL染色結(jié)果提示，TGF-β1作用24h后，HK-2細(xì)胞較正常組凋亡明顯增多，加入不同濃度的AS-IV后，HK-2細(xì)胞凋亡隨著AS-IV作用濃度的增加而逐漸減輕(各濃度與TGF-β1組比較)，以200 μg/ml最為明顯(圖2)。

AS-IV對UUO小鼠腎臟組織TGF-β1表達(dá)的影響 Western 印跡結(jié)果顯示，UUO組在術(shù)后14天腎組織TGF-β1表達(dá)量較Sham組明顯增加(P<0.01),AS-IV干預(yù)后，小鼠腎臟TGF-β1表達(dá)量較UUO組明顯下降(P<0.01)(圖3A)。

AS-IV對UUO小鼠模型凋亡的影響 Western 印跡結(jié)果顯示，UUO損傷14d后，可見cleaved caspase-3表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01)，AS-IV干預(yù)后，與UUO損傷組比較，cleaved-caspase 3表達(dá)受到顯著抑制(P<0.01)(圖3B)。TUNEL染色結(jié)果提示，UUO損傷14天后，腎臟組織細(xì)胞(尤其是腎小管上皮細(xì)胞，見圖3C中箭頭)凋亡增加，AS-IV能減輕細(xì)胞凋亡(圖3C)。

AS-IV對JNK MAPK信號(hào)蛋白表達(dá)的影響 體外實(shí)驗(yàn)中，Western 印跡結(jié)果顯示，TGF-β1刺激24h后，HK-2細(xì)胞JNK磷酸化(主要磷酸化p54和磷酸化p46位點(diǎn))顯著升高(P<0.01)，AS-IV干預(yù)后，隨AS-IV濃度增加，p-JNK表達(dá)逐漸下降，200 μg/ml的作用最為明顯(P<0.01)(圖4A)。體內(nèi)研究中，UUO損傷14天后，p-JNK(主要是磷酸化p46位點(diǎn))相對表達(dá)量較Sham組顯著升高(P<0.01)，AS-IV干預(yù)后p-JNK較UUO組表達(dá)顯著下降(P<0.01)(圖4B)。

圖2 AS-IV對TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響AS-Ⅳ：黃芪甲苷；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子β1；*：與正常組比較，P<0.01；##：與TGF-β1組比較，P<0.01

……

圖4 AS-Ⅳ對JNK MAPK信號(hào)通路的影響AS-Ⅳ:黃芪甲苷；JNK：c-Jun氨基末端激酶；MAPK：絲裂原活化蛋白激酶；A：AS-Ⅳ對TGF-β1刺激下HK-2細(xì)胞表達(dá)p-JNK蛋白的表達(dá)影響；B：AS-Ⅳ對UUO模型小鼠腎組織p-JNK蛋白的表達(dá)影響；**：與對照組比較，P<0.01；*：與TGF-β1組比較，P<0.01

討 論

細(xì)胞凋亡參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，腎損傷可引起腎臟細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡過度又可進(jìn)一步加重腎組織的損傷[6]。在損傷因素刺激下，腎小管上皮細(xì)胞的凋亡與增殖的異常失衡，是導(dǎo)致腎纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素[7]。目前已有許多研究發(fā)現(xiàn)凋亡在腎纖維化進(jìn)程中的重要作用。Thomas等[8]通過5/6腎切除建立實(shí)驗(yàn)性腎纖維化模型發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，腎組織的細(xì)胞凋亡與增殖顯著增加，細(xì)胞凋亡數(shù)量與腎小管間質(zhì)纖維化程度呈正比。Gobé等[9]通過向SD大鼠一次性注射三甲胺-2-氫溴酸鹽，建立慢性藥毒性腎損傷，發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡是腎皮質(zhì)的腎小管萎縮的主要原因。王軒等[10]通過乙型肝炎病毒x基因轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細(xì)胞過度凋亡能夠?qū)е履I小管間質(zhì)纖維化。本研究中我們在單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻損傷第14天時(shí)小鼠腎組織細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞凋亡下游關(guān)鍵酶caspase 3活化明顯增多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示凋亡是腎纖維化的重要特征。

TGF-β1是TGF-β家族的成員之一，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的功能。研究已證實(shí)，TGF-β1是介導(dǎo)腎臟纖維化的重要細(xì)胞因子，其中TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡在此過程中起重要作用。許多纖維化動(dòng)物模型報(bào)道，過度表達(dá)TGF-β1可促使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，增加細(xì)胞凋亡，促進(jìn)膠原合成，而降低TGF-β1及其下游細(xì)胞因子表達(dá)，可降低腎小管上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生。Miyajima等[11]在單側(cè)輸尿管梗阻動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，給予抗TGF-β1抗體干預(yù)后，明顯減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善腎臟纖維化。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型腎組織細(xì)胞凋亡增多時(shí)，TGF-β1表達(dá)也增多；進(jìn)一步體外研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激HK-2細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而TGF-β家族具有“雙刃劍”的特性，還可發(fā)揮抗感染、抗增殖(抑制腫瘤生長)的作用，另有研究完全阻斷TGF-β1 或采用高劑量的TGF-β1 抗體，反而對機(jī)體產(chǎn)生不利影響[12]。因此，TGF-β1 介導(dǎo)的下游信號(hào)分子在其發(fā)揮生理作用中可能更具針對性，是目前廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族是普遍存在于包括酵母和哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多種生物細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，由一組具有絲氨酸/蘇氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，受細(xì)胞外刺激而激活。MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞許多基本的生理活動(dòng)，包括基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、炎癥應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等[13,14]。經(jīng)典的MAPK家族的信號(hào)通路主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶(ERK)、c-Jun N端激酶(JNK)/應(yīng)激激活的蛋白激酶(SAPK)、p38 MAPK途徑。部分學(xué)者認(rèn)為TGF-β1是通過MAPK途徑介導(dǎo)凋亡。Ma等[15]在單側(cè)輸尿管梗阻動(dòng)物模型中，分別利用沉默JNK基因和給予抑制劑兩種方式抑制JNK通路活化，發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡程度顯著減輕。部分研究采用轉(zhuǎn)染技術(shù)使TGF-β1型受體不能激活Smad信號(hào)，但仍可以激活MAPK通路的活性，發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激后仍可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說明p38、JNK MAPK是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路[16,17]。我們在體內(nèi)和體外研究中都發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻和TGF-β1能夠磷酸化JNK，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示JNK MAPK通路在細(xì)胞凋亡中可能起重要作用。

中藥黃芪具有補(bǔ)氣、固表、利水消腫之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有降低蛋白尿，保護(hù)殘腎功能，延緩腎病進(jìn)展的作用，是腎科常用藥。AS-Ⅳ是黃芪中提取的重要單體，是黃芪藥理作用的主要效應(yīng)分子，藥代動(dòng)力學(xué)顯示其在肝臟和腎臟含量較高[18]。國內(nèi)一項(xiàng)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)[19]，AS-IV能夠發(fā)揮抗氧化和抗足細(xì)胞凋亡的作用。隨著學(xué)者們對AS-IV研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)其對腎臟MAPK信號(hào)通路具有調(diào)控作用。Gui等[12]通過建立腎缺血再灌注和順鉑誘導(dǎo)腎損傷兩個(gè)動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)AS-IV部分通過抑制p38 MAPK信號(hào)活化起到腎臟保護(hù)作用，并減少腎組織細(xì)胞凋亡；但沒有進(jìn)一步研究ERK和JNK的活性變化。Zheng等[20]則發(fā)現(xiàn)，AS-IV可通過JNK和ERK1/2磷酸化起到保護(hù)足細(xì)胞的作用，抑制補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架丟失，維持足細(xì)胞形態(tài)。本研究結(jié)果顯示，AS-IV可顯著抑制單側(cè)輸尿管梗阻及TGF-β1 誘導(dǎo)的JNK MAPK 活化，降低單側(cè)輸尿管梗阻小鼠腎組織中TGF-β1 的表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡。

本研究尚存在一些不足之處。體內(nèi)研究中，我們發(fā)現(xiàn)AS-IV能夠減少UUO小鼠模型中TGF-β1的表達(dá)，改善腎臟細(xì)胞凋亡，但并沒有完全明確AS-IV是否直接通過減少腎臟組織TGF-β1表達(dá)進(jìn)而改善細(xì)胞凋亡，AS-IV可能通過調(diào)控TGF-β1的以外的方式改善細(xì)胞凋亡。另外，AS-IV調(diào)控UUO小鼠JNK磷酸化的研究中，我們尚未明確腎臟組織中具體何種細(xì)胞JNK MAPK信號(hào)通路在AS-IV改善細(xì)胞凋亡中起主要作用。因此，黃芪甲苷的靶向作用點(diǎn)將是我們今后研究的重點(diǎn)。

綜上所述，AS-IV能夠抑制TGF-β1表達(dá)，改善TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制JNK MAPK信號(hào)通路相關(guān)。AS-IV有望成為治療CKD的有效藥物之一，具有重要的潛在價(jià)值。

1 Zhang L,Wang F,Wang L,et al.Prevalence of chronic kidney disease in China:a cross-sectional survey.Lancet,2012,379(9818):815-822.

2 Liu Y.Renal fibrosis:new insights into the pathogenesis and therapeutics.Kidney Int,2006,69(2):213-217.

3 Wynn TA.Fibrosis under arrest.Nat Med,2010,16(5):523-525.

4 García-Sánchez O,López-Hernández FJ,López-Novoa JM.An integrative view on the role of TGF-b in theprogressive tubular deletion associated with chronickidney disease.Kidney Int,2010,77(11):950-955.

5 Wang Q,Shao X,Xu W,et al.Astragalosides IV inhibits high glucose-induced cell apoptosis through HGF activation in cultured human tubular epithelial cells.Ren Fail,2014,36(3):400-406.

6 Sanz AB,Santamaría B,Ruiz-Ortega M,et al.Mechanisms of renal apoptosis in health and disease.J Am Soc Nephrol,2008,19(9):1634-1642.

7 Johnson A,DiPietro LA.Apoptosis and angiogenesis:an evolving mechanism for fibrosis.FASEB J,2013,27(10):3893-3901.

8 Thomas GL,Yang B,Wagner BE,et al.Cellular apoptosis and proliferation in experimental renal fibrosis.Nephrol Dial Transplant,1998,13(9):2216-2226.

9 Gobé GC,Axelsen RA.The role of apoptosis in the development of renal cortical tubular atrophy associated with healed experimental renal papillary necrosis.Pathology,1991,23(3):213-223.

10 王軒,周益,朱楠,等.乙型肝炎病毒X基因轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討.腎臟病與透析腎移植雜志,2012,21(6):507-512.

11 Miyajima A,Chen J,Lawrence C,et al.Antibody to transforming growth factor-β ameliorates tubular apoptosis in unilateral ureteral obstruction.Kidney Int,2000,58(6):2301-2313.

12 Gui D,Huang J,Liu W,et al.Astragaloside IV prevents acute kidney injury in two rodent models by inhibiting oxidative stress and apoptosis pathways.Apoptosis,2013,18(4):409-422.

13 Yang C,Yan J,Yuan G,et al.Induction of Tca8113 tumor cell apoptosis by icotinib is associated with reactive oxygen species mediated p38-MAPK activation.Pharmazie,2014,69(8):629-632.

14 Li Y,Liu Y,Fu Y,et al.The triggering of apoptosis in macrophages by pristine graphene through the MAPK and TGF-beta signaling pathways.Biomaterials,2012,33(2):402-411.

15 Ma FY,Flanc RS,Tesch GH,et al.A pathogenic role for c-Jun amino-terminal kinase signaling in renal fibrosis and tubular cell apoptosis.J Am Soc Nephrol,2007,18(2):472-484.

16 Yu L,Hébert MC,Zhang YE.TGF-beta receptor-activated p38 MAP kinase mediates Smad-independent TGF-beta responses.EMBO J,2002,21(14):3749-3759.

17 Itoh S,Thorikay M,Kowanetz M,et al.Elucidation of Smad requirement in transforming growth factor-beta type I receptor-induced responses.J Biol Chem,2003,278(6):3751-3761.

18 Chang YX,Sun YG,Li J,et al.The experimental study of Astragalus membranaceus on meridian tropsim:the distribution study of astragaloside IV in rat tissues.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2012,911:71-75.

19 Gui D,Guo Y,Wang F,et al.Astragaloside IV,a novel antioxidant,prevents glucose-induced podocyte apoptosis in vitro and in vivo.PLoS One,2012,7(6):e39824.

20 Zheng R,Deng Y,Chen Y,et al.Astragaloside IV attenuates complement membranous attack complex induced podocyte injury through the MAPK pathway.Phytother Res,2012,26(6):892-898.

(本文編輯 春 江)

Effects of Astragaloside IV on the apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by transforming growth factor-β1

TIANLei1*,XUWeijia2*,ZHANGZhen1,SHAOXinghua1,XIEYuanyuan1,WANGQin1,WANGLing1,CHEXiajing1,NIZhaohui1,MOUShan1

1DepartmentofNephrology,MolecularCellLaboratoryforKidneyDisease,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200127,China2DepartmentofNephrology,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand，F(xiàn)ujian350000，China*TIANLeiandXUWeijiaareconsideredtobefirstauthors

MouShan(E-mail:shanmou_renji@126.com)

Objective：To investigate the effects of Astragaloside IV (AS-IV) on the apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by transforming growth factor-β1 (TGF-β1). Methodology：In vitro, normal human renal tubular epithelial cells (HK 2) were stimulated with recombinant TGF-β1 (10 ng/ml) and simultaneously treated with different concentrations of AS-IV (50, 100, and 200 μg/ml) for 24 h. In vivo, the unilateral ureteral obstruction (UUO) model was constructed. Mice in AS-IV group were orally administrated AS-IV 20 mg·kg-1·d-1for 7 days after operation, and mice in other groups were administrated the equal volume vehicle. Bilateral kidneys were collected on the 14th day after operation. Western blot was used to detect the expression levels of cleaved caspase 3, c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p-JNK. Cell viability was determined by a cell count kit and apoptosis was estimated by TUNEL staining. Results：Cell viability was significantly inhibited and cell apoptosis was increased by TGF-β1 stimulating for 24h, while those phenomenon were notably attenuated by AS-IV treatment, and the 200 μg/ml AS-IV was the optimal effect (P<0.01). The proteins expression of TGF-β1 and cleaved caspase 3 were increased significantly in UUO kidney tissues (P<0.01), which was also reversed by AS-IV administration (P<0.01). AS-IV inhibited JNK MAPK signals both in vivo and in vitro (P<0.01). Conclusion：AS-IV could attenuate the apoptosis of renal tubular epithelial cells induced by TGF-β1. The mechanism of AS-IV protective effect might be associated with inhibition of JNK MAPK phosphorylation.

Astragaloside IV transforming growth factor β1 apoptosis c-Jun N-terminal kinase

“973” 課題(2012CB517602)；港澳臺(tái)科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(2014DFT30090)；國家自然科學(xué)基金(81102700，81373865)；上海市高級(jí)中西醫(yī)結(jié)合人才培養(yǎng)項(xiàng)目(ZYSNXD012-RC-ZXY017)；上海市科委項(xiàng)目資金(12401906400，14140903200)

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎臟科，分子細(xì)胞(腎病)實(shí)驗(yàn)室(上海，200127)；2南京軍區(qū)福州總醫(yī)院腎內(nèi)科；*田 磊和徐維佳為共同第一作者

牟 姍(E-mail:shanmou_renji@126.com)

2014-11-13

? 2015年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有