鐘 波 那 宇 周 磊 韋加美

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血液透析治療中透析器和透析液對急性期蛋白及細胞因子的影響

鐘 波 那 宇 周 磊 韋加美

目的：評估血液透析(HD)過程細胞因子白細胞介素6(IL-6)和一些急性期蛋白[C反應蛋白(CRP)和分泌型磷脂酶A2(sPLA2)]的水平，分析HD誘導的急性期反應與透析膜類型或透析液的關系。 方法：10例患者行標準HD治療，在透析開始、透析結束及透析后24h留取血液樣本，分別檢測IL-6,CRP 和 sPLA2水平，所有患者分別使用改良型纖維素膜透析器(FB)和聚砜膜透析器(PS)，另外5例患者為增強HD治療，即纖維素膜透析器加上一組透析液濾器(FBf)。 結果：FB組和FBf組在透析結束時IL-6水平顯著高于透析開始時(P<0.05)，在透析后24h IL-6降至基礎水平，相反，PS組透析的患者IL-6水平無明顯波動。在透析結束時FB組和FBf組IL-6水平顯著高于PS組患者(P<0.05)；FB和FBf組透析后24h時平均CRP水平顯著高于透析后水平(P<0.05)。兩組患者在透析后24h sPLA2水平較透析結束時顯著增高(P<0.05)。透析結束時IL-6水平與透析后24h CRP (r=0.67,P<0.01)水平和sPLA2(r=0.52,P<0.05)水平顯著正相關。但是使用PS膜透析患者，CRP以及sPLA2水平均無顯著性變化。 結論：與PS膜相比，FB 和 FBf膜透析治療結束時血清IL-6水平顯著升高，與開始透析后24h后血清CRP 和 sPLA2水平的升高顯著正相關。因此，誘導HD急性期反應的原因中，透析膜的生物學特性較透析液細菌學標準(正常范圍內)意義更大。

血液透析 急性期反應 C反應蛋白 白細胞介素6 分泌型磷脂酶A2

在血液透析(HD)過程中，患者血液和體外循環(huán)的各種人工材料(透析器、透析管路)之間相互接觸產生特異性反應，臨床上稱之為生物不相容性[1]，對機體而言透析材料是一種異物，長期暴露在透析循環(huán)中，反復刺激引導機體產生急性期反應。急性期反應在HD相關并發(fā)癥有重要意義，包括感染風險增加、營養(yǎng)不良和分解代謝增強、透析相關淀粉樣變，最終導致病死率增加。同時，這種生物不相容性對急性期反應的類型和程度也有重要影響。

急性期反應是機體對炎癥和組織破壞后產生的一系列反應狀態(tài)，它由機體內復雜的集成網絡介質進行調控，包括前炎性細胞因子，如白細胞介素1β (IL-1β),腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素6 (IL-6)。IL-6主要來源于人體外周血單核細胞(PBMC)。細胞因子主要介導生成急性期反應蛋白，包括C反應蛋白 (CRP)和分泌型磷脂酶A2(sPLA2)。目前的臨床診療過程中， CRP廣泛應用于監(jiān)測急性期反應的過程和程度。通常在炎性刺激8～10h后，血清CRP水平開始增加，最終能達到正常值的數百倍。

臨床常見的透析相關性急性期反應綜合征包括發(fā)熱和低血壓反應，主要原因為PBMC激活，進而前炎性細胞因子的大量釋放[1]。透析患者PBMC能被多種因素激活，包括補體活化、直接與透析膜接觸、醋酸鹽透析液、細菌污染所產生的內毒素等。透析患者急性期反應是否主要由細胞因子激活的物質引導，臨床研究尚有很多疑問[2-4]。

本實驗旨在分析維持性HD患者急性期反應的原因和程度。通過對比生物不相容性透析膜(FB)和相對生物相容性膜(PS)來觀察透析膜的生物學特征對急性期反應的影響，同時通過對比碳酸氫鹽透析液和超純透析液來評估透析液污染對上述反應的影響。

對象和方法

研究對象 入選10例患者參與臨床實驗，男性4例、女性6例，維持性HD時間至少18月(中位時間40月；范圍19～166月)。所有參試患者均簽署了知情同意書，中位年齡為62歲(范圍41～77歲)腎衰竭的基礎疾病包括：高血壓腎硬化6例、成人多發(fā)性腎囊性變2例、慢性腎盂腎炎1例、止痛藥腎病1例。除外標準包括：接觸透析膜后有過敏反應的患者、惡性腫瘤、肝臟疾病、自身免疫性疾病、接觸過免疫抑制劑及近期有發(fā)熱和感染的患者。

研究方法

實驗設計 實驗設計為2部分，第一部分為隨機交叉對照研究，對補體激活程度較高的FB透析器和補體激活程度低的PS膜透析器進行對比分析。為建立一個穩(wěn)定的血-膜接觸時間，參試患者分別使用兩種透析膜進行透析治療，每組持續(xù)3周，每周3次，每次4h。在每周第三次透析時患者均留取血液標本，在透析開始、透析結束從透析管路的動脈側留取，透析后24h通過正常靜脈穿刺留取。在透析開始對透析液進行無菌取樣，取三次結果均值進行統(tǒng)計分析。實驗的第二部分，隨機選取5例患者進行增強HD治療，使用超純透析液(費森尤斯4008S提供制造超純透析液裝置)，同樣按照上述研究草案進行實施。

透析操作步驟 所有參試患者均使用FB膜透析器 (FB150A,日本)和PS膜透析器(F7HPS,費森尤斯,德國)。FB150A膜材料為改良型醋酸纖維素膜，表面積為1.4 m2γ射線滅菌，超濾率為12.5 ml/(mmHg·h)，F7HPS膜材料為聚砜膜，表面積為1.3 m2高壓蒸汽滅菌，超濾率為14 ml/(mmHg·h)。HD治療前，透析器均使用含有5 000 IU 肝素的生理鹽水1 000 ml預沖。按照患者個體需要，血流量調整至200～300 ml/min。超濾(UF)率范圍(300～1 000 ml/h)。肝素抗凝，起始劑量范圍1 500～4 000 IU,維持劑量250～1 250 IU/h。透析液使用反滲水稀釋濃縮的碳酸氫鹽原液技術。費森尤斯4008S使用內毒素濾器以獲得超純透析液。

分析方法

IL-6 IL-6在EDTA血漿中檢測，使用酶免疫分析法(EIA)。樣本常規(guī)離心(10 min,1 500 r/min),-20℃保存。按照試劑盒制造商指導的方法檢測，測定低限為0.5 pg/ml。(人IL-6 ELISA 試劑盒48T 上海恒遠)。

CRP 常規(guī)比濁法測定血清CRP水平。測定低限為2 mg/L，在統(tǒng)計分析中，凡是結果低于測定低限的數據均指定為1 mg/L。檢測儀器：整合式生化分析儀西門子(Dimension RXL Max/Xpand Plus)。試劑盒：CRP測定試劑盒(免疫比濁法)(RCRP)

sPLA2sPLA2在EDTA血漿中檢測，使用酶免疫分析法，測定低限為0.1 ng/ml,健康對照組人群均低于5 ng/ml[5](人sPLA2 ELISA 試劑盒48T 上海凱博)。

內毒素檢測 無菌采集透析液樣本，-20℃保存，內毒素活性定量標準采用透析液樣本和鱟變形細胞溶解物/底物混合分析法(內毒素快速檢測試劑盒 湛江博康)。

透析液細菌學評估 無菌采集透析液樣本，37℃孵育48h后，總平板細菌計數在葡萄糖酵母瓊脂平板完成，綿羊紅細胞技術在瓊脂平板完成。

統(tǒng)計方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，資料使用均數±標準差表示，當數據分布均衡時，用中位數和分布范圍表示。成對變量的變異分析使用成對t檢驗，相關性分析使用Pearson’s相關分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

IL-6 三種透析模式(PS,FB和FBf)透析前IL-6平均水平無顯著性差異。使用PS膜透析的患者透析過程中IL-6水平無顯著波動。反之，FB 和 FBf組患者透析后IL-6水平較透析前顯著性增高(FB組:從透析開始時3.7±1.2 pg/ml到透析結束時9.4±2.9 pg/ml,t=-3.00,df=10,P<0.05； FBf組:從透析開始時3.5±0.8 pg/ml到透析結束時7.9±4.1 pg/ml,t=-3.17,df=6,P<0.05)。在透析結束時，PS組患者IL-6水平和FB以及 FBf組患者有顯著性差異(P<0.05)。而FB和FBf組患者之無顯著性差異。透析24h后，FB組及FBf組患者，IL-6水平均降至正常水平(圖1)。

圖1 血液透析前后PS、FB及FBf組患者血清IL-6濃度IL-6：白細胞介素6；PS：聚砜膜；FB：醋酸纖維膜；FBf:醋酸纖維膜f濾器；*：與PS組比較，P<0.05

CRP和sPLA2三種透析模式(PS,FB和FBf)透析前CRP和sPLA2平均水平無顯著性差異。使用PS膜透析的患者透析過程中CRP和sPLA2平均水平均無顯著波動。反之，使用FB膜透析，CRP(圖2)和sPLA2(圖3)平均水平在透析后24h較透析結束時均顯著增高(CRP:從透析結束5.6±1.1 mg/L到透析后24h 7.9±1.7 mg/L,t=-2.73,df=10,P<0.05； sPLA2:從t1807.1±1.2 ng/ml到透析后24h 12.2±2.7 ng/mlt=-3.16,df=10,P<0.05)。對于FBf組患者，CRP和sPLA2平均水平在透析后24h較透析結束時均明顯增高 (CRP:從透析結束5.9±1.9 mg/l到透析后24h 8.2±3.7 mg/L，P<0.05；sPLA2:從透析結束6.2±2.4 ng/ml到透析后24h 13.8±2.9 ng/ml，P<0.05)。FB和FBf組患者CRP平均水平在透析后24h較PS組患者增高，但只有FBf組患者的增高具有統(tǒng)計學意義(FB組:t=2.00,df=9,P=0.08； FBf組:t=4.32,df=6,P<0.01)。另外，FB和FBf組患者sPLA2平均水平在透析后24h較PS組患者均顯著性增高，(FB組:t=2.30,df=9,P<0.05；FBf組:t=2.50,df=6,P<0.05)，而FB和FBf組患者之間無顯著差異。

圖2 透析前后PS、FB及FBf組患者血清CRP濃度PS：聚砜膜透析器；FB：改良型纖維素膜透析器；FBf：透析液濾器；CRP：C反應蛋白

圖3 透析前后PS、FB及FBf組患者血清sPLA2濃度PS：聚砜膜透析器；FB：改良型纖維素膜透析器；FBf：透析液濾器；sPLA2：分泌型磷脂酶A2

透析液內毒素檢測指標 使用內毒素濾器獲得的超純透析液與標準透析液相比，內毒素水平有顯著性差異(但均在正常允許范圍之內)，超純透析液：中位數0.06 (0.05～0.19) EU/ml；標準透析液：中位數0.18 (0.05～1.13) EU/ml(P<0.05)。

透析液細菌培養(yǎng) 所有超純透析液樣本只有一份檢測到細菌生長，而超純透析液細菌含量較標準透析液有顯著性差異，超純透析液：中位數0 (0～10) cfu/ml；標準透析液：中位數45 (0～480) cfu/ml(P<0.05)。

IL-6、CRP與sPLA2之間相關性分析 三組患者(PS、FB 和 FBf)累計資料表明在透析結束時平均IL-6水平與透析后24h CRP水平(r=0.67,P<0.01；圖4A)及sPLA2水平(r=0.52,P<0.05；圖4B)顯著正相關。

內毒素與IL-6、CRP、sPLA2之間相關性分析 檢測出內毒素濃度無論是與透析結束時IL-6水平，還是與透析后24h急性期蛋白水平均無顯著相關性(IL-6:r=-0.32 NS；CRP:r=-0.27 NS； sPLA2:r=-0.25 NS)。

圖4 三組透析患者(PS,FB 和 FBf)累計資料表明透析結束時IL-6水平和透析后24hCRP水平呈顯著正相關(A)，同時與透析后24h sPLA2水平顯著正相關(B)PS：聚砜膜透析器；FB：改良型纖維素膜透析器；FBf：透析液濾器；IL-6：白細胞介素6；sPLA2：分泌型磷脂酶A2；CRP：C反應蛋白

討 論

本實驗旨在評估HD引起生物非相容性反應的機制，主要通過測定急性期蛋白定量來評估， 觀察該反應是否來源于透析膜的生物特性或透析液的細菌學指標。實驗中對比兩種類型透析器：改良型醋酸纖維素膜(FB,纖維素材料，中通量，中補體激活性)和聚砜膜(PS,合成膜材料，中通量，低補體激活性)，同時，設定超純透析液透析模式，即FB透析膜+超純透析液(FBf)，所有透析液均為碳酸氫鹽緩沖液。

使用PS膜透析的患者，在所有觀察時間點檢測到的IL-6、CRP與sPLA2水平均無明顯變化，說明PS膜有良好的生物相容性。對于FB和FBf組患者，透析結束時IL-6水平顯著增加，而透析后24h CRP與sPLA2水平顯著增加。FB和FBf組患者之間無顯著性差異，即使用標準透析液與超純透析液檢測結果無影響。另外，所有三組患者(PS、FB和FBf)累計資料表明透析液內毒素含量(允許范圍內)與透析結束IL-6水平及透析后24h急性期蛋白水平無顯著相關性。

實驗結果還表明透析結束時血清IL-6平均水平與透析后24h CRP平均水平顯著正相關，透析治療過程中CRP水平基本無變化，在炎性刺激后8～10h CRP水平才逐漸增高[6]，這與我們的實驗結果相吻合。

血清CRP水平升高是低蛋白血癥[5-6]、特異或非特異性炎癥、急性冠脈綜合征以及心血管事件的危險因素。維持性HD患者CRP平均水平普遍升高，尤其是使用纖維素膜透析器的患者。本實驗通過評估不同膜材料透析器透析過程中IL-6的增高與透析后24h急性期蛋白升高之間的關聯(lián)，以及標準透析液和超純透析液對急性期蛋白的變化的影響。結果提示CRP與sPLA2的變化基本吻合，而臨床普遍認為CRP與sPLA2聯(lián)合作用，促進損傷細胞的吞噬作用，因而加重炎性反應以及組織損害[7]，甚至可以認為這種病理生理過程是維持性HD患者各種慢性并發(fā)癥的致病機制。

有資料表明，使用標準透析液與超純透析液相比[8]，細胞內IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)含量顯著增加，從而誘導PBMC活性增加。但也有一項研究針對高通量血液透析[10]，分別使用標準碳酸氫鹽透析液和超純碳酸氫鹽透析液，對比細胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)及細胞因子受體拮抗劑[IL-1Ra,可溶性 TNF 受體(sTNFR) p55和p75]均無顯著性差異。我們的實驗結果并不支持透析液的細菌學指標(透析液中內毒素含量及透析液細菌培養(yǎng)菌落計數)作為臨床碳酸氫鹽透析過程前炎性細胞因子及急性期蛋白生成的關鍵指標。對于通量相對較高的PS透析膜，透析過程中無明顯細胞因子釋放，透析間期也沒有明顯急性期蛋白生成。對于中通量FB透析膜，透析過程中IL-6明顯增加，透析后24h也能檢測到顯著的急性期反應，這種情況與透析液的細菌學指標(正常范圍內)無關。另外，其他多種因素，如補體激活、直接接觸透析膜產生的膜衍生介質均可能在FB透析膜介導的急性期反應過程中發(fā)揮作用[9-10]。

綜上所述，使用FB透析器會誘導在透析結束時IL-6水平顯著提升，這與在透析后24h CRP和sPLA2的增高存在顯著相關性，而與透析液的細菌學質量無關(內毒素含量及透析液細菌培養(yǎng)菌落計數)，而使用PS透析器則未發(fā)現上述變化。因此，在HD相關的機體急性期反應過程中，透析膜的特性比透析液的細菌學質量發(fā)揮更重要的作用。

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8 Bouré T,Vanholder R.Which dialyser membrane to choose? Nephrol Dial Transplant,2004,19 (2):293-296.

9 王質剛.透析患者氧化應激.王質剛.血液凈化學.第三版.北京:北京科學技術出版社,2010,1023-1029.

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(本文編輯 紀 文)

Effects of dialyser and dialysate on the acute phase proteins and cytokines in patients with hemodialysis

ZHONGBo,NAYu，ZHOULei，WEIJiamei

DepartmentofNephrology,306HospitalofPLA,Beijing100101,China

WEIJiamei(E-mail:13693378340@163.com)

Objective：To estimate the levels of cytokine release (interleukin-6, IL-6) and subsequent production of acute phase proteins (C-reactive protein, CRP and secretory phospholipase A2, sPLA2) in patients with hemodialysis (HD) and investigate whether the HD-induced acute phase reaction depends on the type of membrane or dialysate. Methodology：The levels of IL-6, CRP and sPLA2levels were assessed in blood samples drawn before, at the end and 24h after the start of HD in ten HD patients. All patients were dialysed on fibrin diacetate (FB) and Polysulphon (PS) dialysers, and 5 patients underwent an additional HD session on FB plus a dialysate filter (FBf). Results：The IL-6 levels in patients with FB and FBfwere increased significantly at the end of HD (P<0.05). After 24 h of HD, the IL-6 levels had returned to baseline, while it did not occur during HD with PS. At the end of HD, the IL-6 was significantly greater with FB and FBfdevices, than that with PS (P<0.05). The levels of CRP in patients with FB and FBfwasincreased significant after 24 h of HD, compared with postdialysis values (P<0.05). In addition, the levels of sPLA2were significantly increased after 24h of HD, compared with that at the end of HD (P<0.05). The IL-6 levels at t180were significantly correlated with the levels of CRP (r=0.67,P<0.01) and sPLA2(r=0.52,P<0.05) after 24h of HD. During HD with PS membranes, the CRP or sPLA2values were not significantly changed. Conclusion：In contrast to PS, both FB and FBfelevated serum IL-6 levels at the end of HD, which correlated with increased the levels of CRP and sPLA224h later. Therefore, the membrane types, rather than the bacterial quality of the dialysate, were responsible for the induction of the acute phase response during HD.

haemodialysis acute phase response C-reactive protein interleukin-6 secretory phospholipase A2

“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAI10B08)；“十二五”全軍重大項目(AWS11J013)

北京市解放軍306醫(yī)院腎內科(北京，100101)

韋加美(E-mail:13693378340@163.com)

2014-11-13

? 2015年版權歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有