明星，周學(xué)迅

為了將基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的成果充分應(yīng)用到臨床疾病診治中，近年來(lái)，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的概念逐漸興起，作為有望成為跨越這個(gè)鴻溝的橋梁，生物樣本庫(kù)如雨后春筍般地出現(xiàn)在全國(guó)各地，科研工作者也把目光投向生物樣本庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)以及隨之而來(lái)的價(jià)值發(fā)掘上[1]。然而，生物樣本庫(kù)普遍存在樣本數(shù)量少、樣本數(shù)據(jù)不完整、質(zhì)量不達(dá)標(biāo)等現(xiàn)象，嚴(yán)重地影響了相關(guān)研究結(jié)果的可靠性[2-3]。因此，高效地獲取和存儲(chǔ)質(zhì)量合格、數(shù)據(jù)完整的生物樣本，并更有效地為醫(yī)學(xué)研究服務(wù)，便成為生物樣本庫(kù)行業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。隨著技術(shù)的不斷革新，解決上述問(wèn)題的方法不斷被探索出來(lái)，這其中最重要之一就是“自動(dòng)化”?！白詣?dòng)化”能最大效率地提高樣本制備質(zhì)量，降低交叉污染，提高樣本準(zhǔn)備和處理速度，可追蹤溯源從而降低出錯(cuò)風(fēng)險(xiǎn)[4]。“自動(dòng)化”因其更統(tǒng)一、規(guī)范、高效的特點(diǎn)，成為了生物樣本庫(kù)的下一個(gè)發(fā)展方向。本文旨在介紹自動(dòng)化在生物樣本庫(kù)中的應(yīng)用現(xiàn)狀，希望能為同行起到借鑒作用。

1 自動(dòng)化樣本前處理

液體樣本，尤其是血液樣本，因其廣泛的應(yīng)用價(jià)值，成為了最普遍收集的生物樣本。血液一般被分離成血漿、血清、白膜層或外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）等組分，再進(jìn)行進(jìn)一步核酸提取或直接進(jìn)行分裝儲(chǔ)存。每一個(gè)凍存管上面都有唯一的識(shí)別碼，并用樣本管理系統(tǒng)（managing system for inventory，MSI）控制其在冰箱的位置。血液樣本的前處理很復(fù)雜，手工操作模式已經(jīng)不能滿足高通量、多步驟的樣本處理所需要的高效性、準(zhǔn)確性及安全性，液體樣本前處理工作站的誕生解決了這個(gè)難題。

現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的樣本前處理工作站有 Freedom Evo200?（Tecan，瑞士）液體樣本前處理工作站、MicroLab?STAR（Hamilton，瑞士）全自動(dòng)液體處理工作站等（圖1）[5]。有些系統(tǒng)內(nèi)有條碼識(shí)別裝置，可掃描獲取采血管及凍存管對(duì)應(yīng)的信息，精確分裝。整合于部分系統(tǒng)內(nèi)的離心機(jī)能夠?qū)崿F(xiàn)樣本的全自動(dòng)裝載、平衡和離心，可以根據(jù)樣本處理的具體需要，設(shè)定離心時(shí)間、溫度和速度?？筛咄?、自動(dòng)化完成整個(gè)樣本制備流程。該系統(tǒng)能識(shí)別離心后采血管中的白膜層和分離膠層，并自動(dòng)將不同組分分裝至不同的目標(biāo)管中。白膜層的回收率比傳統(tǒng)的吸取法提高了將近一倍，達(dá) 95%以上[6]。在離心轉(zhuǎn)速、時(shí)間、分離液和凍存方法一樣的情況下，手動(dòng)和自動(dòng)的方法獲取 PBMCs 并進(jìn)行凍存后復(fù)蘇細(xì)胞的活性的比較，結(jié)果無(wú)差異[7]。自動(dòng)化完成乏味的白膜層和PBMCs 移液處理，可解放實(shí)驗(yàn)室勞動(dòng)力。對(duì)于開(kāi)展生物液體樣本液相色譜-質(zhì)譜分析的樣本庫(kù)而言，全自動(dòng)液體處理工作站還可以用來(lái)做分析前的液體處理[8]。

圖1 MicroLab? STAR（Hamilton，瑞士）全自動(dòng)液體處理工作站，可進(jìn)行自動(dòng)加樣、試劑分配、移液和分裝

樣本儲(chǔ)存的成分越單一，穩(wěn)定性越強(qiáng)。相較于直接凍存，盡早地對(duì)血液或組織進(jìn)行核酸提取再加冷凍保護(hù)劑的儲(chǔ)存方法能最大程度地保護(hù)核酸。高質(zhì)量的核酸提取決定下一步實(shí)驗(yàn)如基因測(cè)序、基因芯片、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等結(jié)果的可靠性[4]。手動(dòng)的核酸提取方法的原理是有機(jī)溶劑抽提法，獲取的純度，濃度較低，受人為操作影響較大，一致性差。另外，提取過(guò)程繁瑣，工作量繁重，且提取過(guò)程會(huì)造成健康傷害。最初的自動(dòng)化核酸提取法是濾膜分離，相較于最新的磁珠分離法，提取的產(chǎn)量和純度有限，長(zhǎng)片段提取效果差，試劑不開(kāi)放，使用成本高，磁珠分離法具有能提取微量樣本，試劑開(kāi)放，方便使用等優(yōu)點(diǎn)（表1）。

如今，核酸提取設(shè)備的種類繁多，該如何挑選呢? 我們總結(jié)了國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較普遍的自動(dòng)化核酸提取儀并比較了通量、樣本體積及所需時(shí)間（表2）。

Kim 等[9]比較了三種常用的自動(dòng)化核酸提取設(shè)備提取的患者咽拭子的核酸，并用 RT-PCR 進(jìn)行呼吸道病毒的核酸驗(yàn)證。他們發(fā)現(xiàn)，不同的系統(tǒng)對(duì)不同的核酸具有不同的特異性和敏感性，所以樣本庫(kù)應(yīng)該根據(jù)自身特色，如樣本種類，目的核酸等選擇自動(dòng)核酸提取設(shè)備。自動(dòng)化核酸提取系統(tǒng)的發(fā)展趨勢(shì)是：通量逐漸加大，提取時(shí)間持續(xù)縮短。比如，面向大型樣本庫(kù)的自動(dòng)化核酸提取系統(tǒng) Kingfisher Flex（Thermo Fisher，美國(guó)）和 Chemagic 360?（PerkinElmer，美國(guó)）等，在 30～60min 內(nèi)最多實(shí)現(xiàn) 96 個(gè)樣本的核酸提取，后者用 12 孔道適配器時(shí)樣本體積達(dá)到 10 ml。國(guó)產(chǎn)的iAUTOMAG?（百泰克）、TGuide M16/M48?（天根）等儀器以最大通量工作時(shí)，單樣本的處理體積達(dá)到 2 ml 以上。

表1 不同核酸提取方法的比較

表2 國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較普遍的自動(dòng)化核酸提取儀的通量、所需時(shí)間以及最大處理體積的比較

樣本的熱缺血/冷缺血時(shí)間、反復(fù)凍融次數(shù)、儲(chǔ)存時(shí)間等都跟樣本的質(zhì)量息息相關(guān)。在標(biāo)準(zhǔn)化采集儲(chǔ)存的前提下，仍需要定期進(jìn)行質(zhì)量檢查。質(zhì)量不達(dá)標(biāo)的樣本需要及時(shí)出庫(kù)銷毀，騰出儲(chǔ)存空間，有助于樣本庫(kù)的良性運(yùn)轉(zhuǎn)。對(duì)于樣本庫(kù)管理人員而言，對(duì)不同的樣本，需要選擇對(duì)應(yīng)可信的質(zhì)量控制方法。自動(dòng)化全覆蓋的質(zhì)控工作平臺(tái)能輕松解決質(zhì)控的難題。傳統(tǒng)的核酸質(zhì)控依靠電泳后的條帶以及紫外分光光度計(jì)測(cè)量的濃度和純度，目前廣泛應(yīng)用的 2100 Bioanalyzer?生物分析儀（Agilent，美國(guó)）結(jié)合了電泳和流式細(xì)胞儀的檢測(cè)方法，可以對(duì) DNA、RNA、蛋白及細(xì)胞進(jìn)行純度、濃度、數(shù)量等的檢測(cè)，產(chǎn)生高質(zhì)量的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，真正用一個(gè)平臺(tái)解決多樣本樣本庫(kù)質(zhì)控的難題[10]。

新一代樣本庫(kù)的概念中，強(qiáng)調(diào)數(shù)據(jù)的質(zhì)量及完整性[11]。傳統(tǒng)的樣本數(shù)據(jù)獲得是依靠人工從醫(yī)療機(jī)構(gòu)醫(yī)院醫(yī)療信息系統(tǒng)（hospital information system，HIS）、醫(yī)院檢驗(yàn)信息系統(tǒng)（laboratory information system，LIS）、醫(yī)院影像傳輸系統(tǒng)（picture archiving and communication system，PACS）中摘抄?，F(xiàn)如今，MSI 與這些系統(tǒng)無(wú)縫對(duì)接，使得患者信息自動(dòng)被抓取，節(jié)省了勞動(dòng)力的同時(shí)保證數(shù)據(jù)的可靠性及安全性。還有一些小型自動(dòng)化裝置，包括自動(dòng)旋蓋、自動(dòng)封蓋、自動(dòng)排序、整板讀碼裝置及對(duì)應(yīng)的預(yù)置識(shí)別碼的凍存管，可以輔助液體樣本前處理工作站，使整個(gè)樣本前處理成為一條自動(dòng)化鏈。

2 自動(dòng)化存儲(chǔ)和出庫(kù)

理論上來(lái)說(shuō)，樣本儲(chǔ)存的溫度越低，越接近離體時(shí)的狀態(tài)[12]。對(duì)于短期儲(chǔ)存，可以選擇 –20℃自動(dòng)化存儲(chǔ)系統(tǒng)，對(duì)于戰(zhàn)略性收集的樣本，因儲(chǔ)存時(shí)間較長(zhǎng)，普遍應(yīng)用 –80℃及 –196℃自動(dòng)化存儲(chǔ)系統(tǒng)。

德國(guó)國(guó)家隊(duì)列（German national cohort，GNC）自 2014年10月1日正式啟動(dòng)項(xiàng)目以來(lái)，在 18 個(gè)分中心的同步收集下，短短八個(gè)月，收集的樣本量達(dá)到 170 萬(wàn)，平均每日入庫(kù) 2000 個(gè)樣本，包括全血、血清、血漿、紅細(xì)胞、RNA、尿液、唾液、鼻黏膜分泌物以及糞便，與樣本同時(shí)收集的還有每個(gè)受試者完整的健康檔案，樣本庫(kù)運(yùn)轉(zhuǎn)壓力非常大。為了最大限度地保護(hù)如此龐大且寶貴的資源，GNC樣本庫(kù)將 2/3 的基線樣本及后續(xù)的隨訪樣本都存儲(chǔ)在德國(guó)環(huán)境健康中心的自動(dòng)化生物樣本庫(kù)中，該中心配有全球唯一的百萬(wàn)級(jí)雙系統(tǒng)（–80℃和 –196℃）（LiCONiC，列支敦士登）自動(dòng)化樣本庫(kù)，剩下 1/3 的基線樣本則將存儲(chǔ)在各個(gè)本地的研究中心并用于本地分析和作為備份存儲(chǔ)[13]。

LiCONiC 公司的自動(dòng)化智能存儲(chǔ)系統(tǒng)是目前很多大型樣本庫(kù)的選擇，德國(guó)的格賴夫斯瓦爾德大學(xué)醫(yī)學(xué)院開(kāi)展的名為“格賴夫斯瓦爾德對(duì)個(gè)性化醫(yī)療的探索”的隊(duì)列樣本庫(kù)[14]及瑞典隆德大學(xué)生物樣本庫(kù)[15]等也應(yīng)用不同型號(hào)的 LiCONiC自動(dòng)化存儲(chǔ)系統(tǒng)，智能化地解決大量樣本的入庫(kù)、儲(chǔ)存及出庫(kù)問(wèn)題。

英國(guó)國(guó)家樣本庫(kù)作為一個(gè)大型前瞻性研究的樣本庫(kù)，調(diào)查遺傳因素、環(huán)境暴露以及生活方式在中老年群體的重大疾病的發(fā)病過(guò)程中所起的作用。依照異地備份的原則，總共1500 萬(wàn)份分裝的樣本將分別存儲(chǔ)在 2 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的樣本庫(kù)中：其中 950 萬(wàn)份樣本存儲(chǔ)在 –80℃自動(dòng)化儲(chǔ)存系統(tǒng)中[4]，剩下的 550 萬(wàn)份存儲(chǔ)在 –180℃手動(dòng)操作液氮存儲(chǔ)系統(tǒng)中[16]。

圖2 以 Biolix STC（LiCONiC，列支敦士登）–80℃自動(dòng)化智能存儲(chǔ)系統(tǒng)為例，展示了自動(dòng)化存儲(chǔ)系統(tǒng)的基本架構(gòu)。自動(dòng)化存儲(chǔ)系統(tǒng)有以下三個(gè)基本工作模塊：樣品接收（或輸出），樣本輸送，樣本存入（或出庫(kù)）。組成的硬件包括接收區(qū)、輸送機(jī)械臂、低溫儲(chǔ)存區(qū)（冰箱或液氮罐），均接受樣本管理軟件傳達(dá)的指令。國(guó)內(nèi)樣本庫(kù)的自動(dòng)化存儲(chǔ)概念還處于萌芽階段，生物芯片上海國(guó)家工程中心等機(jī)構(gòu)已率先開(kāi)始試點(diǎn)使用，自動(dòng)化存儲(chǔ)現(xiàn)象的普及只是時(shí)間問(wèn)題。

圖2 自動(dòng)化存儲(chǔ)系統(tǒng)的基本架構(gòu)（①樣本接收區(qū)；②輸送機(jī)械臂；③樣本儲(chǔ)存區(qū)；④、⑤冷卻系統(tǒng)；⑥液氮后備制冷系統(tǒng)；⑦空氣干燥器）

3 小結(jié)

由于大規(guī)模樣本庫(kù)項(xiàng)目樣本存儲(chǔ)周期長(zhǎng)，附加信息量大，樣本來(lái)源多中心化等因素，往往承載了巨大的價(jià)值。樣本庫(kù)的自動(dòng)化建設(shè)和實(shí)施可保證樣本被高效管理的同時(shí)確保信息的絕對(duì)可追溯性，盡可能地杜絕人為差錯(cuò)。自動(dòng)化使得樣本存取準(zhǔn)確化、存儲(chǔ)環(huán)境的高質(zhì)量化和流程的科學(xué)化都得到了顯著的提高，可以極大地促進(jìn)我國(guó)生物樣本庫(kù)行業(yè)的科學(xué)管理和資源共享，為各項(xiàng)重大科研課題研究做貢獻(xiàn)。然而，樣本庫(kù)的自動(dòng)化依然處于剛剛起步的階段，自動(dòng)化設(shè)備費(fèi)用高昂，一般規(guī)模的樣本庫(kù)無(wú)法應(yīng)用。我們期待，在不久的將來(lái)，隨著技術(shù)的革新，自動(dòng)化設(shè)備的成本能降低，又或者，各個(gè)分中心的樣本由具有自動(dòng)化處理及儲(chǔ)存能力的第三方協(xié)助統(tǒng)一儲(chǔ)存并管理，用較小的成本達(dá)到高質(zhì)量?jī)?chǔ)存的目的。

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