吳美琴，吳宇航，趙麗，周光迪，趙莎莎，王偉業(yè)

作為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、個體化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域必不可少的寶貴資源，生物樣本的價值在于其本身既有疾病相關(guān)個體特異的臨床信息，又可以通過一系列生物技術(shù)手段獲得實驗室的實驗信息。比如對腫瘤的遺傳基因分型以及高風(fēng)險的遺傳標(biāo)志（基因型體質(zhì)、風(fēng)險家族史等）多方位的分析，再結(jié)合相應(yīng)患者的臨床表現(xiàn)（基因型與表現(xiàn)型的符合性與特異性）和生活習(xí)慣（如環(huán)境暴露相關(guān)的致病風(fēng)險因子）等信息可以對疾病發(fā)生的相關(guān)性做更加全面、可靠的分析，其結(jié)果可為臨床治療提供任何實驗室研究或臨床觀察分析所不可能提供的依據(jù)[1]。

隨著人們對醫(yī)學(xué)生物樣本價值認(rèn)識的提高以及各方面的投入和支持，以醫(yī)院為主體的眾多生物樣本庫迅速建立，加上疾病種類和資源豐富等特點，與歐美國家相比，我國在較短的時間內(nèi)積累了大量的生物樣本資源。隊列研究是病因?qū)W研究的重要方法，是將某一特定人群按是否暴露于某可疑因素或暴露程度分為不同的亞組，追蹤觀察兩組或多組成員結(jié)局（如疾病）發(fā)生的情況，比較各組之間結(jié)局發(fā)生率的差異，從而判定這些因素與該結(jié)局之間有無因果關(guān)聯(lián)及關(guān)聯(lián)程度的一種觀察性研究方法。而該類研究近年來在國內(nèi)也得到迅速發(fā)展，積累了大量的樣本資源，相應(yīng)的隊列樣本庫建設(shè)也隨之發(fā)展起來[2]。與以醫(yī)院為主體建設(shè)的生物樣本庫相比，隊列生物樣本庫的特點就是樣本資源大多來源于多個不同的樣本收集點（單個中心的隊列項目除外）。目前我國樣本庫發(fā)展還處于初期建設(shè)階段，建設(shè)和發(fā)展水平和規(guī)范程度，技術(shù)人員掌握的技術(shù)能力差異性大，隨之帶來相互之間的關(guān)鍵問題表現(xiàn)在兩個方面：一是樣本從收集到制備的異質(zhì)性（sample heterogeneity）；二是統(tǒng)一制定的工作流程在各樣本中心的執(zhí)行一致性不易做到，再加上隊列研究有比較長期的隨訪，一些小的差異性可能會隨著樣本收集面廣和時間長逐步放大，變得更加顯著。因此如何管理多中心的樣本庫建設(shè)和樣本收集之間的一致性是多中心隊列生物樣本資源面臨的挑戰(zhàn)。多中心隊列生物樣本庫為了使各中心的樣本資源保持一致性，除通常制定一系列相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（standard operation protocol，SOP）和系統(tǒng)性培訓(xùn)相關(guān)工作人員外，目前存在的主要問題是：首先，協(xié)調(diào)中心如何系統(tǒng)化監(jiān)控和跟蹤各中心的工作流程，就是多中心之間的協(xié)同性；其次，如何根據(jù)各中心的實際情況，權(quán)衡現(xiàn)實工作中SOP 的必要性和可行性，使得 SOP 得以在各中心都能夠真正被使用；再次，如何建立一套質(zhì)量保證（quality assurance，QA）評估流程并對各中心的實際操作進(jìn)行評估；最后，對于已經(jīng)不能避免以及解決不了的問題，怎么處理？這些問題導(dǎo)致的樣本異質(zhì)性是目前多中心隊列研究面臨的棘手問題——即多中心隊列研究能否兼顧生物樣本資源和相關(guān)數(shù)據(jù)信息的數(shù)量和質(zhì)量。

環(huán)境與兒童健康教育部和上海市重點實驗室在上海市衛(wèi)生計生委的資助下從 2012年開始在整個上海市開展多中心的出生隊列研究，截至目前，已經(jīng)有 6 家單位參與本項目。在國內(nèi)，想要和國外很多多中心隊列研究一樣，在規(guī)定時間內(nèi)將新鮮采集的樣本集中到一個中心（或協(xié)調(diào)中心）處理，人、財、物等多方面的可行性都不強(qiáng)。故本項目在設(shè)計上采用了折中的辦法——將新鮮的樣本先在各中心處理、分裝和暫存，然后定期運(yùn)送回新華醫(yī)院生物樣本庫長期儲存。本文接下來將詳細(xì)描述項目組如何協(xié)調(diào)不同中心之間的工作流程和管理方式，探討如何進(jìn)行多中心隊列研究協(xié)同管理的模式，希望能在一定程度上為相關(guān)、相似生物樣本庫建設(shè)和管理者提供思路和方向。

1 方法

1.1 協(xié)同管理的方法

1.1.1 信息化管理 采用協(xié)調(diào)中心的生物樣本庫信息化管理系統(tǒng)對各中心的樣本庫進(jìn)行工作流程的協(xié)同管理，各中心采用統(tǒng)一的模板對樣本生命周期相關(guān)信息進(jìn)行詳細(xì)記錄，更好地監(jiān)控各中心生物樣本留取的整個過程。

1.1.2 質(zhì)量保證評估 在項目實施過程中為了監(jiān)控各中心對統(tǒng)一制定的 SOP 的執(zhí)行力和執(zhí)行率，項目組編制了《隊列研究監(jiān)查訪視報告》，對各中心的樣本庫進(jìn)行不定期的監(jiān)查訪視。

1.1.3 SOP 的制定和修改 除了讓各中心遵循協(xié)調(diào)中心統(tǒng)一制定的 SOP 外，項目組還根據(jù)信息化管理和質(zhì)量保證評估得到的各中心信息的比較結(jié)果和訪視過程中直接發(fā)現(xiàn)的問題進(jìn)行決策，對 SOP 范圍內(nèi)能夠解決的問題，及時通知相關(guān)中心進(jìn)行改正；對執(zhí)行力不強(qiáng)的 SOP，啟動相應(yīng)的變更程序，及時修改和精簡，使得各中心都能夠按照統(tǒng)一的SOP 來操作。

表1 樣本采集、接收、處理時間記錄數(shù)據(jù)集

1.1.4 問題記錄 各中心對已經(jīng)存在的并且沒有辦法解決的問題及時記錄下來，匯總到協(xié)調(diào)中心，協(xié)調(diào)中心通過信息化管理系統(tǒng)注釋到所對應(yīng)的樣本上面。

1.2 統(tǒng)計方法

采用 IBM SPSS Statistics 19.0 對各協(xié)作單位相關(guān)信息進(jìn)行比較；其余圖表使用 Microsoft Office 2007 進(jìn)行制作。

2 結(jié)果

2.1 生命周期相關(guān)信息記錄和系統(tǒng)化管理

各個協(xié)作中心通過使用統(tǒng)一的生物樣本信息導(dǎo)入模板，除記錄生物樣本的基礎(chǔ)臨床信息以外，對各樣本留取過程時間進(jìn)行了詳細(xì)的記錄，由此協(xié)調(diào)中心生物樣本庫得到了各中心樣本庫樣本保存過程的信息資料。如表1 所示，模板中記錄樣本離體到進(jìn)入凍存狀態(tài)所經(jīng)歷的各個階段的時間記錄格式。協(xié)調(diào)中心將收集到的各中心的相關(guān)信息通過數(shù)據(jù)集的形式添加到樣本上面，圖1 是信息化管理系統(tǒng)中時間記錄數(shù)據(jù)集的注釋的內(nèi)容；通過記錄，項目組可以清楚知道各個中心樣本離體后每個環(huán)節(jié)時間耽擱的長短，便于明確責(zé)任，尋找問題，進(jìn)而解決問題，提高工作效率和水平。

同時項目組對各中心樣本的運(yùn)輸環(huán)節(jié)也進(jìn)行了詳細(xì)記錄和管理。所有的樣本運(yùn)輸過程由專業(yè)的冷鏈物流運(yùn)輸公司操作，將各中心的樣本統(tǒng)一運(yùn)送到新華生物樣本庫儲存，運(yùn)輸全程實行溫度監(jiān)控，實時記錄運(yùn)輸過程中的溫度。如圖2所示是 2015年3月26日上午 2 個小時左右的運(yùn)輸過程的溫度監(jiān)控記錄，由圖可知整個過程的溫度控制穩(wěn)定，一直保持在 –80℃左右。樣本接收人員可以通過核對溫度監(jiān)控記錄和樣本運(yùn)輸單上的時間，協(xié)同管理各中心樣本運(yùn)輸過程中樣本的溫度。

圖1 生物樣本庫信息化管理系統(tǒng)中時間記錄數(shù)據(jù)集的注釋

圖2 出生隊列生物樣本運(yùn)輸溫度監(jiān)控記錄

2.2 隊列研究監(jiān)查訪視報告

主要監(jiān)控內(nèi)容包括樣本采集和轉(zhuǎn)運(yùn)、樣本處理和保存、樣本信息記錄、樣本運(yùn)輸以及隨訪過程中的失訪率等。如圖3 呈現(xiàn)了隊列研究監(jiān)查訪視報告的部分內(nèi)容，可以看出該被訪視中心存在的問題很多，項目組需要對這些問題及時、逐一進(jìn)行處理和解決，否則該中心在這種情況下采集和處理的樣本和其他中心的會有差異，影響樣本的整體質(zhì)量。

圖3 隊列研究監(jiān)查訪視報告部分截圖

2.3 各中心相關(guān)信息的比較結(jié)果

監(jiān)查訪視和樣本生命周期信息記錄的目的是能夠從中整理、統(tǒng)計、總結(jié)得到項目實施過程中存在的問題，以便于尋找解決問題的方法，使得各中心能夠協(xié)同參與項目。圖4是我們按照樣本采集時各個點的時間記錄，選取了兩家醫(yī)院的某一個月份中的胎盤樣本的數(shù)據(jù)，經(jīng)統(tǒng)計分析得到的圖。通過對胎盤采集、運(yùn)送和處理時間比較，很容易發(fā)現(xiàn)醫(yī)院 B的樣本離體后送到樣本庫所經(jīng)過的時間（T1）和樣本庫收到樣本到樣本開始處理所經(jīng)過的時間（T2）特別長，即分娩后胎盤沒有及時送到樣本庫，樣本送達(dá)樣本庫后，樣本庫工作人員沒有及時處理，從而導(dǎo)致醫(yī)院 B 的胎盤從離體到入庫的時間（T4）特別的長。

圖4 醫(yī)院 A、B 胎盤樣本采集、運(yùn)送和處理時間的比較

2.4 問題處理方法

首先針對如上述的醫(yī)院 A、B 胎盤樣本采集、運(yùn)送和處理時間的比較之類問題，在原來 SOP 范圍內(nèi)能夠解決的，項目組工作人員將此情況及時反映給醫(yī)院 B 的樣本監(jiān)察員，由他去醫(yī)院 B 實地查看以發(fā)現(xiàn)問題：是分娩后樣本采集人員沒有及時通知運(yùn)送人員，還是樣本運(yùn)送人員沒有及時運(yùn)送胎盤；另外，什么原因?qū)е聵颖静僮魅藛T沒有及時處理胎盤？是每天樣本庫需要處理的樣本太多，需要增加該醫(yī)院的樣本操作人員，還是其他的原因。原因明確后，按照胎盤處理的 SOP 督促和改進(jìn)醫(yī)院 B 的胎盤收集的整個流程。圖5 顯示的是醫(yī)院 B 在改進(jìn)方案前后各階段時間的比較，很容易看出該醫(yī)院在 T1、T2 時間的控制上有了很大的進(jìn)步，總時間 T4 由原來的 61.34 h，縮減到 38.69 h，當(dāng)然和醫(yī)院 A 的 13.03 h 相比，還有待進(jìn)一步的改進(jìn)。以此螺旋式改進(jìn)提高的方法，逐步達(dá)到各個研究機(jī)構(gòu)的協(xié)同管理。另外我們的統(tǒng)計結(jié)果還顯示出一個很好的結(jié)果，就是醫(yī)院 A 和醫(yī)院 B 所有的 T3，即胎盤處理所花費(fèi)的時間體現(xiàn)了一致性，都在 2 小時左右，這表明樣本庫工作人員在對各個中心樣本庫操作人員的培訓(xùn)上是成功的。

圖5 醫(yī)院 B 改進(jìn)前后胎盤樣本采集、運(yùn)送和處理時間的比較

表2 胎盤、臍帶處理標(biāo)準(zhǔn)化操作程序版本變更記錄

其次，對于訪視過程中發(fā)現(xiàn)的 SOP 執(zhí)行力低，即 SOP的操作性不強(qiáng)的問題，項目組對 SOP 進(jìn)行修改、精簡，使得 SOP 在各個中心都得以實施。例如在項目實施過程中由于各協(xié)作單位日分娩量、預(yù)算以及分娩流程上的硬性規(guī)定等的限制，我們對胎盤采集處理的 SOP 經(jīng)過了多次的修改。表2 是項目實施過程中胎盤 SOP 版本變更記錄。從表中可以看到生物樣本庫需要如何采集保存何種疾病的何種類型的生物樣本及其信息資源這個問題沒有統(tǒng)一的固定模式和標(biāo)準(zhǔn)答案，像隊列研究這種以項目為導(dǎo)向的樣本庫，需要根據(jù)項目的需求和自身情況來決定，關(guān)鍵目的是需要各個中心都能執(zhí)行所制定的 SOP。

最后，對已經(jīng)存在的，沒有辦法解決的問題應(yīng)及時記錄下來。如前面監(jiān)查訪視報告中所描述的“樣本采集后運(yùn)送到樣本庫過程中沒有使用冰袋”，這是已經(jīng)發(fā)生的事情，對于發(fā)現(xiàn)和改正之前所收集的樣本我們沒有好的辦法將這種狀態(tài)進(jìn)行改進(jìn)，但是也不能因為這個失誤，就將該中心之前收集的樣本做銷毀處理，最佳的處理辦法就是將樣本的這些信息都詳細(xì)記錄下來，以便于今后數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析時查看。

3 討論

多中心隊列研究生物樣本收集非常突出的問題就是各中心生物樣本收集的一致性，而如何在分散的各中心統(tǒng)一管理樣本采集、處理、分裝、暫存、運(yùn)輸以及數(shù)據(jù)的收集等協(xié)調(diào)中心沒有辦法直接干預(yù)的過程是保證各中心樣本質(zhì)量一致性的關(guān)鍵。這也充分體現(xiàn)了分析前變量（pre-analytical factors）對樣本質(zhì)量的巨大影響。而本項目采用了各中心都能夠接受的簡便易行的方法，對樣本在各中心經(jīng)歷的生命周期中的不同階段進(jìn)行記錄、追蹤和比較，以保證各中心在樣本處理各階段的一致性。生物樣本庫的基本要求除了樣本取材的準(zhǔn)確性、樣本質(zhì)量的可控性以及建設(shè)、運(yùn)轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)化外，相關(guān)信息的完整性和可跟蹤性也是其不可或缺的部分[3]。對于隊列研究而言，其信息的完整性是建立在可跟蹤性得以實現(xiàn)的基礎(chǔ)上的，如果對研究對象沒有很好地跟蹤隨訪，就會導(dǎo)致其信息的缺失和不完整，最后分析結(jié)果出現(xiàn)難以預(yù)料的偏差。生物樣本庫信息化管理系統(tǒng)在該問題的解決過程中起到了關(guān)鍵作用。

生物樣本是不可再生的寶貴資源，而樣本質(zhì)量是整個樣本庫的核心，除了制定一系列的 SOP 以保證樣本采集、處理、分裝、運(yùn)輸、保存等過程的規(guī)范性，從而保證各樣本的質(zhì)量，SOP 制定后操作人員遵循度才是最關(guān)鍵的。如果寫歸寫，做歸做，制定的 SOP 就會成為一紙空文，沒有任何意義。對于國內(nèi)比較新興的多中心出生隊列研究來說，由于樣本的操作不能像國外一樣，在樣本離體后 24 h 內(nèi)送到統(tǒng)一的中心進(jìn)行處理，而是需要在各家參與單位的樣本庫進(jìn)行直接處理，這就更加大了 SOP 執(zhí)行率的判斷難度。如何知曉統(tǒng)一培訓(xùn)后的各中心樣本庫工作人員對 SOP 的執(zhí)行率，項目組采取了定期對項目各中心樣本庫監(jiān)查訪視的辦法，這樣很容易發(fā)現(xiàn)各個中心對 SOP 的遵循情況和各中心間的差異。如圖3 監(jiān)查訪視報告中提到的尿液分裝前需要用電動移液器進(jìn)行混勻操作，尿液處理的 SOP 中是明確寫明和要求——“尿液用移液管反復(fù)吸吹 15 次，將尿液混勻”。這是很容易做到的，但是在實際操作中各個中心的執(zhí)行率是不同的，有 7 次，10 次，12 次……，即使是同一個操作人員，在處理不同捐獻(xiàn)者的尿液時，吸吹的次數(shù)也不一樣。這樣的差異雖然很小，但是從科學(xué)研究嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度出發(fā)，樣本量達(dá)到一定數(shù)目，是會造成統(tǒng)計學(xué)上的差異。如果沒有監(jiān)查訪視，項目組不可能及時發(fā)現(xiàn)這些問題，更談不上及時解決和改正。沒有這些預(yù)防性的措施來改進(jìn)樣本的質(zhì)量，而是等到樣本收集完成后依靠某一個檢測指標(biāo)的測定來對樣本進(jìn)行質(zhì)量控制，就為時已晚，沒有補(bǔ)救措施。而各中心操作上的參差不齊，將會嚴(yán)重影響樣本本身的質(zhì)量。

不論是樣本生命周期中相關(guān)信息的記錄，還是質(zhì)量保證評估，目的都是為了及早發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，最終目標(biāo)是使得各中心收集回來的樣本和數(shù)據(jù)趨于一致，從而達(dá)到協(xié)同管理各中心樣本庫的目的。并且項目組認(rèn)為采取這樣的管理模式是可行的，也是可信的。在胎盤樣本各階段時間記錄來看，新生兒的出生時間是準(zhǔn)確無誤的；胎盤送到樣本庫的時間也是可信的，因為運(yùn)送人員和接收人員需要同時簽字；樣本入庫時間是樣本庫信息化管理系統(tǒng)記錄的，沒有辦法改變；樣本開始處理的時間受到樣本入庫時間的限制，同時樣本處理的時間基本是固定不變的。由此邏輯，項目組設(shè)定了此方法，該方法不僅僅是為了找到問題出在哪里，也不是責(zé)備和懲罰出錯之人，而是從錯誤中學(xué)到知識，以便從能夠優(yōu)化改進(jìn)的地方入手，逐步使各中心都向著所有中心都能實現(xiàn)的目標(biāo)努力，提高樣本整體質(zhì)量。

而對于相關(guān)信息分析得出的結(jié)果，項目組會根據(jù)實際情況采取不一樣的方法來協(xié)同各中心。主要的解決辦法不外乎①及時改進(jìn)：操作過程中一些細(xì)節(jié)且各中心都能很容易做到的，最好方式是各中心都朝著統(tǒng)一的 SOP 來努力，使得各中心在操作上保持一致性。②精簡 SOP：SOP 不是越嚴(yán)格越好。SOP 內(nèi)容的可行性和科學(xué)性直接關(guān)系到實驗數(shù)據(jù)的質(zhì)量和完整性，也只有在實際使用過程中不斷地對 SOP 的可行性及科學(xué)性進(jìn)行優(yōu)化，SOP 才更完善，更符合自己的實際情況，提高各中心樣本庫的遵從性，更好地確保樣本的質(zhì)量和隨訪數(shù)據(jù)的完整性。如項目組就胎盤處理的 SOP 經(jīng)過了多個版本的修訂，最終精簡和降低要求，使得這個 SOP在參與項目的各個中心樣本庫都可行。最早制定胎盤 SOP前，我們查閱和參考了國際上已經(jīng)開展的隊列研究對其處理的方法，但發(fā)現(xiàn)不盡相同：如英國的 ALSPAC 研究是將整個胎盤浸泡在福爾馬林中處理后室溫保存[4]；而丹麥的奧胡斯出生隊列研究是沒有保存胎盤樣本，而僅保存了 2 管1 ml 的臍帶組織于凍存管中[5]。本項目在多個中心開展，各個中心的招募流程和診療程序會因為各醫(yī)院的規(guī)定而有所不同，使得在胎盤的采集和處理上統(tǒng)一處理的難度加大。所以在制定第一版時，項目組經(jīng)過再三討論，才將總的目標(biāo)確定下來，后面的修改是在原來版本基礎(chǔ)上的簡化。這樣的修訂在整理項目實施過程中還有很多，胎盤處理 SOP 的修訂只是其中的一個例子。③記錄實情：SOP 版本的修訂可以改善新版本 SOP 實施后的樣本質(zhì)量，但是由于參與本項目的各中心不是同一時間參與的，所以會經(jīng)歷不同版本的SOP。即最先參與的中心可能使用了所有版本的 SOP，而后面參與進(jìn)來的，也許只使用了后面兩個版本的 SOP。這些信息都必須記錄下來，一旦樣本檢測后遇到難以解釋的結(jié)果，可以查詢這些記錄，可以探討是不是不同版本 SOP操作引起的。同時通過這些分析前變量的記錄，為今后使用正規(guī)的樣本預(yù)分析標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范（standard PREanalytical code，SPREC）系統(tǒng)奠定一定基礎(chǔ)，可以通過批量導(dǎo)入后進(jìn)行代碼解析[6]。這也是協(xié)同管理多中心生物樣本庫的方法之一。對于記錄下來的信息，可在統(tǒng)計分析時作為混雜因素進(jìn)行分層分析或控制變量。

隊列研究和生物樣本庫建設(shè)是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的兩大研究資源，協(xié)同管理多中心隊列研究中各生物樣本庫的建設(shè)將為今后的研究提供更加高質(zhì)量的樣本和更加可靠的數(shù)據(jù)信息，也將加大各方面數(shù)據(jù)的整合和多平臺的合作，實現(xiàn)合理高效利用樣本資源，實現(xiàn)資源共享，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

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