劉 照 戴新華 李孟婉 李紅梅 暴海霞 江 游

(中國計量科學研究院，北京 100029)

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冰凍人血清中黃體酮成分分析標準物質的研制*

劉 照 戴新華 李孟婉 李紅梅 暴海霞 江 游

(中國計量科學研究院，北京 100029)

本文介紹了研制的冰凍孕婦血清中黃體酮成分分析標準物質。采用超高效液相色譜-同位素稀釋質譜法(UPLC-ID-MS/MS)對孕婦血清中黃體酮含量進行了測量，其定值結果為21.89ng/g。同時采用美國NIST標準物質和氣相色譜-同位素稀釋質譜法進行了定值驗證，結果表明定值準確。對該標準物質進行了均勻性檢驗和穩(wěn)定性監(jiān)測，實驗結果表明，其均勻性和穩(wěn)定性檢驗結果均符合國家一級標準物質技術要求。

黃體酮；血清；標準物質；超高效液相色譜-同位素稀釋質譜

0 引言

黃體酮是人體內重要的性激素之一，對維持女性正常生理周期和生理功能、調節(jié)人機體代謝有重要意義。女性血清孕酮水平隨生理周期的不同而有明顯的變化，一般為l～60ng/mL[1]，男性一般在0.1～0.2ng/mL之間。臨床上測定血清孕酮主要用于黃體功能的判斷和異常妊娠的診斷。其測定的常規(guī)方法主要為免疫分析法[2]，但受校準和方法特異性等原因，不同方法間結果的變異往往比較大，需要可靠的方法和標準物質實現(xiàn)其測定的標準化。為了滿足臨床實驗室檢測的實際需要，本工作研制了孕婦血清中黃體酮成分分析標準物質。

針對冰凍人血清中黃體酮成分分析標準物質的研究，目前國內尚未有文獻報道。本文利用UPLC-ID-MS/MS[3-4]，采用單點法校正[5]，根據(jù)國家一級標準物質技術規(guī)范[6-7]的要求，對冰凍孕婦血清中黃體酮進行了定值、均勻性和穩(wěn)定性的考察，同時對定值結果進行了不確定度評定。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀：TQS，美國waters公司；天平1：METTLER TOLEDO UMX2(Max=2.1 g，d=0.1μg)，德國梅特勒公司；天平2：ME235S(Max=230g，d=0.01mg)，德國賽多利斯公司；移液器：200μL和1000μL，德國；氮氣吹干裝置：BF-2000A，八方世紀公司。

黃體酮純度標準物質[8]：GBW(E)110119，純度99.20%，不確定度為0.5%(中國計量科學研究院)；黃體酮標記物：3,4-13C2,純度90%(美國劍橋同位素實驗室)；甲醇、乙腈和乙酸乙酯：高效液相色譜級(德國Merck公司)；高純水，Millipore，18MΩ·cm；甲酸：質譜級(美國Sigma公司)。

1.2 樣品采集

標準物質研制所需的血清樣品由安貞醫(yī)院和軍事醫(yī)學科學院提供，按照國家標準物質技術規(guī)范[6-7]的要求對備用原料進行過濾、混勻、分裝，具體制備工作由軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所承擔。最終原料孕婦血清采用5mL凍存管包裝，每支血清量2.5mL，在-70℃下冰凍保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 標準儲備溶液與工作標準溶液的配制

配制采用重量法。將一定量的黃體酮純度標準物質和同位素內標分別溶于一定量的甲醇中，配制成濃度為1000μg/g的標準儲備液(-20℃保存)。配制工作標準溶液時用流動相逐級稀釋至與血清中黃體酮的濃度接近，把兩種溶液按照濃度比值為1:l混合均勻，作為加標工作標準溶液，血清樣品中也按照黃體酮與內標物的濃度比值為1:1加入內標溶液。

1.3.2 血清樣品的預處理及其均勻性檢驗

血清屬于復雜基體，尤其是黃體酮含量較低，因此，需要萃取、凈化和濃縮等復雜的前處理技術。溶劑萃取和除蛋白質方法有多篇文獻報道[4,5,9]，本實驗采取了固相萃取(SPE)法[3]從血清中富集黃體酮。準確稱取500μL血清于10mL離心管中，等比例加入黃體酮標記溶液，分別稱量其質量。1)血清樣品用6mL0.5mol/L的磷酸酸化，在室溫下平衡1h；2)用SPE柱分離，先用5mL甲醇和5mL水先后活化SPE柱，以3～4mL/min的速度加樣品溶液，再用12mL水和5mL水/乙腈(80：20體積比)洗滌，最后用2mL甲醇洗脫；3)洗脫液在40℃下氮氣吹干，用0.5mL水復溶后用1mL乙酸乙酯再萃取兩次，將兩次萃取液合并，在40℃下氮氣吹干；4)用流動相復溶到原來濃度，充分渦旋振蕩，經(jīng)0.22μm膜過濾，供UPLC-MS/MS測定。

根據(jù)JJG 1343—2012一級標準物質技術規(guī)范的要求[7]，從孕婦血清樣品中隨機取樣11瓶。每一瓶均獨立取3個子樣。每個子樣測量3次，作為瓶內的均勻性，每瓶的平均值作為瓶間的均勻性。

1.3.3 樣品的穩(wěn)定性考察

按照標準物質研制技術規(guī)范[6-7]的要求，考察了樣品在-70℃下的長期穩(wěn)定性、不同溫度下和凍融性實驗等的短期穩(wěn)定性。

樣品在-70℃下的穩(wěn)定性，按先密后疏的原則，在定值后的第1、3、6月份分別采用UPLC-MS/MS方法抽樣檢測其含量的變化。每次取2個樣品，每個樣品取三個子樣，測3次，取平均值。根據(jù)規(guī)范標準物質定值的通用原則及統(tǒng)計學原理的要求[7]對穩(wěn)定性監(jiān)測數(shù)據(jù)用t檢驗法[6-7]進行計算和穩(wěn)定性評估，結果的變動在定值結果不確定度范圍內作為判定標準物質穩(wěn)定的原則。

1.4 樣品的定值方法

在本研制中，采用UPLC-ID-MS/MS法進行標準物質的定值，并以GC-IDMS方法[5,9]進行定值驗證。

1)色譜條件:色譜柱：ACQUIT UPLCBEH C18柱(2.1×50mm，1.7μm)，流動相的組成：水(含0.1%的甲酸)：甲醇=40：60，流速：0.4mL/min，進樣量：5.0μL，樣品盤溫度為：10℃。

2)質譜檢測條件：采用電噴霧離子源(ESI)對樣品進行離子化，在正離子模式下進行掃描，毛細管電壓：3.00kV；錐孔電壓：30V；離子源溫度：150℃；氮氣壓力：7.0×105Pa；碰撞氣流速：0.15mL/min；數(shù)據(jù)采集時間：7min。采用多反應離子監(jiān)測(MRM)方式，黃體酮和黃體酮同位素內標物的母離子分別為m/z315.3和317.3，選擇相應的子離子m/z97.0和99.0作為定量離子(如圖1)。

圖1 UPLC-ID-MS/MS法測定血清黃體酮和內標物的選擇離子流圖

2 結果與討論

2.1 最小取樣量結果

分別稱取孕婦血清500μL、400μL、300μL、200μL、100μL、50μL，按照1.3中方法進行前處理，采用UPLC-ID-MS/MS測定黃體酮含量。測得黃體酮含量基本一致，因此，采用RSD值為判定標準，當RSD值大于2.0%時，判斷該取樣量太小，不符合要求，最終得到本實驗的最小取樣量為100μL，考慮到不同儀器靈敏度和重復性差異，建議實際定值時取樣量為500μL。

2.2 檢出限和定量限的測定

按照實驗部分，對血清進行相應的前處理和測定，進樣體積為5μL。逐級稀釋樣品，當信噪比(S/N)為3時，得到血清中黃體酮的檢出限為1.2×10-13g。采用同樣方法，當信噪比(S/N)為10時，得到血清中黃體酮的定量限為4×10-13g。

2.3 樣品定值結果與均勻性檢驗

血清中黃體酮濃度采用單點法[5]進行計算，測量結果見表1。

2.4 穩(wěn)定性考察結果

血清穩(wěn)定性考查結果見表2。

從表2數(shù)據(jù)分析可知，血清中黃體酮在-70℃下保存六個月，其穩(wěn)定性經(jīng)t檢驗良好。

2.5 方法驗證

為了驗證所研制的血清樣品中黃體酮定值結果的準確性，我們采用美國國家標準與技術研究院(NIST)的SRM971和GC-ID/MS[5,9]法對標準物質進行定值驗證。

表2 血清黃體酮長期穩(wěn)定性考查結果

2.5.1 采用NIST血清進行定值驗證

采用同樣的定值方法對NIST血清標物SRM971進行測定，平行測定兩次，測定值為1.941ng/g(RSD為0.45%)，在其不確定范圍內(1.835～1.971ng/g)，表明血清中黃體酮定值結果是準確可靠的。

2.5.2 采用GC-ID/MS進行定值驗證

為了進一步驗證該定值結果的準確性，同時采用氣相色譜同位素稀釋質譜(GC-ID/MS)衍生化法[5,9]對孕婦血清進行了測量。前處理過程與UPLC-ID-MS/MS方法一致，洗脫完成后采用七氟丁酸酐進行衍生化反應，衍生反應完成后所得產(chǎn)物用環(huán)己烷溶解，進行GC-MS測量，其結果為21.673ng/g(RSD=0.17%)，與該標準物質標準值的相對偏差為0.986%，且在不確定度范圍內，充分證明了該標準物質定值結果的準確性和可靠性。

2.6 測量結果不確定度的評定

根據(jù)ISO、EURACHEM導則、測量不確定度評定與表示[7]，對血清中黃體酮結果的不確定度進行了評定。

2.6.1 不確定度來源分析

標準物質定值結果的不確定度由標準物質的不均勻性引入的不確定度ubb，標準物質的不穩(wěn)定性引入的不確定度uls以及標準物質定值過程帶來的不確定度uchar三部分組成。將上述三部分不確定度分量合成，得標準物質的合成標準不確定度uCRM：

(1)

2.6.2 不確定度的量化

1)標準物質定值的不確定度分別由儀器測量重復性引入的A類不確定度、天平稱量和純品標準物質引入的B類不確定度合成得到，記為uchar，則計算如下：

=0.844%

2)均勻性引入的不確定度，采用方差分析法進行計算，得到標準物質均勻性引入的相對不確定度，ubb=0.174%。

3)穩(wěn)定性引入的不確定度，血清中黃體酮穩(wěn)定性考察結果表明，血清中黃體酮在考察期間是穩(wěn)定的。同時通過線性擬合，得到標準物質穩(wěn)定性引入的不確定度uls=0.670%。

2.6.3 不確定度的合成

通過上述方法得到不確定度的各分量，按照式(1)將各個分量合成(見表3)得到血清中黃體酮含量的合成標準不確定度為0.48ng/g。

表3 血清中黃體酮成分分析標準物質的標準值和不確定度

3 結論

本項目采用UPLC-ID-MS/MS對血清中黃體酮成分分析標準物質進行定值，與國外方法相比，縮短了分析時間，提高了工作效率，而且避免了復雜費時的衍生化反應，定值技術達到國際先進水平。

均勻性檢驗和長期穩(wěn)定性監(jiān)測結果表明：血清中黃體酮成分分析標準物質均勻性良好，符合國家一級標準物質對穩(wěn)定性的要求，同時該標準物質的研制填補了國內該項空白，完善了臨床黃體酮檢測溯源的參考系統(tǒng)。該標準物質可用于血清黃體酮檢測分析方法的評價、分析過程的質量控制以及對實驗室能力的考核。同時為我國臨床醫(yī)學檢驗、衛(wèi)生檢驗檢疫等方面的測量和研究工作提供技術支撐和量值溯源保障。

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10.3969/j.issn.1000-0771.2015.3.02

*國家科技基礎專項(2011FY130100)、國家科技支撐計劃(2013BAK10B01)和國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2011YQ06008403)