李 靜 郭 莉 李 妍 胡 欣 李紅玉 楊順娥

CYP17基因多態(tài)性與新疆維、漢民族女性乳腺癌相關(guān)性研究

李 靜 郭 莉 李 妍 胡 欣 李紅玉 楊順娥

目的探討CYP17 rs743572位點(diǎn)基因多態(tài)性在新疆維、漢民族女性乳腺癌中的分布與乳腺癌易感性的關(guān)系。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測(cè)130例維吾爾族女性乳腺癌患者、125例維吾爾族正常女性及120例漢族女性乳腺癌患者、118例漢族正常女性的CYP17 rs743572位點(diǎn)多態(tài)性，并分析該位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維、漢民族女性乳腺癌易感性的關(guān)系。結(jié)果在病例組及對(duì)照組中，維、漢兩民族基因型分布及等位基因頻率具有顯著差異(P<0.05)；在維、漢族各亞組中，病例組與對(duì)照組的基因型分布差異及等位基因頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；維、漢兩民族病例組與對(duì)照組各基因型及等位基因均未增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)論病例組、對(duì)照組中維、漢兩民族基因型分布及等位基因頻率具有顯著差異。CYP17基因rs743572位點(diǎn)多態(tài)性與新疆維、漢民族女性乳腺癌的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)。

乳腺癌；CYP17基因；維吾爾族；漢族；基因多態(tài)性

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1588～1592)

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，其發(fā)生發(fā)展存在著顯著的種族及地域的差異。日益增多的研究表明，乳腺癌相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性為不同種族、不同人群乳腺癌發(fā)生差異的根本原因[2]。而由于乳腺癌為雌激素依賴性腫瘤，故與雌激素合成代謝相關(guān)的基因突變最有可能會(huì)改變雌激素的暴露情況，從而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。CYP17基因是參與雌激素合成代謝的關(guān)鍵酶，在其5'編碼區(qū)存在著T→C的多態(tài)位點(diǎn)[3]，即rs743572多態(tài)位點(diǎn)，該多態(tài)性位點(diǎn)的存在影響了CYP17基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響了體內(nèi)雌激素的水平，故與乳腺癌的發(fā)生緊切相關(guān)。目前關(guān)于CYP17基因單核苷酸多態(tài)性與維吾爾族乳腺癌的相關(guān)性未見報(bào)道，本文通過(guò)病例-對(duì)照研究及Logistic回歸分析，探討了CYP17 rs743572位點(diǎn)基因多態(tài)性與新疆維、漢民族女性乳腺癌易感性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

病例組需居住在新疆地區(qū)20年以上，經(jīng)術(shù)后臨床病理確診為乳腺癌，排除既往有化放療、內(nèi)分泌治療及腫瘤病史者，需除外合并嚴(yán)重臟器功能障礙、懷孕及哺乳期婦女。以體檢健康女性為對(duì)照組。維、漢受試者家族中均無(wú)異族通婚史。其中，病例組為2013年1月到2014年9月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的130例維吾爾族及125例漢族初診原發(fā)性乳腺癌的患者，對(duì)照組為三甲綜合性醫(yī)院體檢正常的120例維吾爾族及118例漢族健康女性。結(jié)果顯示，在維吾爾族中，病例組年齡為24～70歲，平均年齡為(45.35±9.33)歲，對(duì)照組年齡為24～66歲，平均年齡為(44.30±9.72)歲，兩組的年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000，P>0.05)；漢族中，病例組年齡為25～73歲，平均年齡為(45.75±8.47)歲，對(duì)照組年齡為23～73歲，平均年齡為(44.95±8.44)歲，兩組年齡分布亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.000，P>0.05)。以上研究對(duì)象為排除擴(kuò)增失敗的樣本。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1.2.1 材料和試劑 血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)，引物使用NCBI網(wǎng)及引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)，由北京奧科鼎盛生物公司合成。Msp I限制性內(nèi)切酶(10 U/μl)購(gòu)自Fermentas公司(加拿大)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 抽取維、漢受試者清晨空腹外周靜脈血2 mL，編號(hào)標(biāo)記，裂解紅細(xì)胞提取DNA，行對(duì)應(yīng)片段PCR擴(kuò)增、限制性內(nèi)切酶酶切、通過(guò)電泳觀察圖譜來(lái)分析序列之間的差異。CYP17 rs743572位點(diǎn)位于5'啟動(dòng)子區(qū)，存在T-C多態(tài)位點(diǎn)。從Genebank中獲取基因序列，引物使用NCBI網(wǎng)及引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)，上游引物：5'-CAT TCG CAC TCT GGA GTC-3'；下游引物：5'-AGG CTC TTG GGG TAC TTG-3'，PCR產(chǎn)物419 bp，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循環(huán)后72 ℃最終延伸7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)2%瓊脂糖凝膠100V 恒定電壓下電泳50 min分離，Marker所示條帶由上至下分別為600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp共6條條帶，當(dāng)PCR產(chǎn)物CYP17在419 bp處出現(xiàn)特異性熒光條帶，表示擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增產(chǎn)物及酶切體系配好于0.2 ml PCR管內(nèi)，37 ℃酶切12 h，經(jīng)過(guò)3.5%瓊脂糖凝膠80 V電壓下電泳50 min。隨機(jī)選取部分CYP17 rs743572基因片段基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因序列的測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，測(cè)得的基因型、等位基因頻率與Hardy-Weinberg平衡的符合程度以及維、漢病例組與對(duì)照組之間等位基因與基因型頻率的比較采用卡方檢驗(yàn)(χ2檢驗(yàn))。應(yīng)用非條件logistic回歸分析計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(odds ratio,OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)分析CYP17基因rs743572基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病的相對(duì)危險(xiǎn)度，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增DNA檢測(cè)結(jié)果

采用紫外分光光度法，檢測(cè)CYP17樣本基因組DNA，結(jié)果顯示，在493個(gè)樣本中，平均濃度為567.20 ng/μL，平均吸光值為1.83。

2.2 PCR擴(kuò)增電泳產(chǎn)物

CYP17 rs743572片段引物擴(kuò)增后產(chǎn)物為419 bp，在Marker標(biāo)記中，其位于500 bp和400 bp條帶之間并接近400 bp，有特異性大小的片段產(chǎn)生。如顯影不佳或未顯影時(shí)需查找原因并重新進(jìn)行檢測(cè)，見圖1。

M為Marker；1～7為PCR產(chǎn)物。

2.3 酶切結(jié)果

未被酶切開的長(zhǎng)度419 bp的一條亮帶為TT型，出現(xiàn)295 bp和124 bp兩個(gè)條帶的為CC型，出現(xiàn)419 bp、295 bp、124 bp 3個(gè)條帶的為TC型，見圖2。

M為Marker;1、2為TT純合子;3、4為CC純合子;5、6為TC雜合子。

2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定

隨機(jī)選取的CYP17 3種基因型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因序列的測(cè)定結(jié)果如圖顯示，測(cè)序結(jié)果中堿基的改變與酶切結(jié)果一致，見圖3。

A為TT基因型(74T);B為CC基因型(74C);C為TC基因型(74C/T)。

2.5 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行CYP17各基因型 H-W 平衡的檢測(cè)，結(jié)果顯示，新疆維吾爾族及漢族的病例組和對(duì)照組的CYP17各基因型分布均符合H-W平衡定律，各P值分別為0.876、0.818、0.965、1.000，提示維、漢民族病例組和對(duì)照組基因型均符合遺傳平衡定律，見表1、2。

2.6 基因型分布

維吾爾族主要為T等位基因攜帶者，而漢族以C等位基因攜帶者為主。在病例組及對(duì)照組中，不同基因型及等位基因頻率在維、漢兩民族中分布的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2值分別為15.864、15.457、9.083、9.201，P<0.05。但在維吾爾族及漢族組中，病例組與對(duì)照組基因型分布及等位基因分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3、4。

表1 維吾爾族病例組和對(duì)照組Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)(例，%)

表2 漢族病例組和對(duì)照組Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)(例，%)

表3 在病例組及對(duì)照組中維漢民族基因型分布及等位基因頻率的比較(例，%)

表4 在維漢民族中各基因型分布及等位基因頻率的比較(例，%)

2.7 CYP17基因型多態(tài)性與乳腺癌的危險(xiǎn)性關(guān)系

Logistic 回歸模型分析顯示，以野生型TT基因型為對(duì)照，TC、CC或TC+CC基因型均與維吾爾族及漢族女性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(P>0.05)。而與等位基因T相比較，攜帶等位基因C亦與維吾爾族及漢族女性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)(P>0.05)，見表5、6。

表5 CYP17各基因型及等位基因型與維吾爾族乳腺癌危險(xiǎn)性的關(guān)系(例，%)

表6 CYP17各基因型及等位基因型與漢族乳腺癌危險(xiǎn)性的關(guān)系(例，%)

3 討論

近40年來(lái)亞洲女性的乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[4]，新疆維吾爾族乳腺癌患病例數(shù)亦呈上升趨勢(shì)，而內(nèi)源性雌激素在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。雌激素參與乳腺癌的發(fā)生一方面是通過(guò)增加乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞有絲分裂作為促癌因子；另一方面，雌激素代謝產(chǎn)物可與DNA結(jié)合，引起DNA損傷和直接導(dǎo)致基因突變作為癌變的啟動(dòng)因子發(fā)揮作用。CYP17是參與雌激素合成代謝的關(guān)鍵酶，位于人類染色體10q24.3區(qū)域，包括7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子，主要催化其它性激素和類固醇激素形成雄激素前體物質(zhì)[5]，從而形成雌激素。

目前發(fā)現(xiàn)CYP17基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)主要為以下3處[3]：①在6內(nèi)含子的5471堿基上存在著一個(gè)C→T的突變位點(diǎn)；②在其編碼區(qū)5'上游的47堿基處存在G→A的突變位點(diǎn)；③在其5'編碼區(qū)的34堿基處有一個(gè)T→C的突變位點(diǎn)，即rs743572多態(tài)位點(diǎn)，該單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)變異為限制性內(nèi)切酶MspA I的酶切位點(diǎn)，此多態(tài)性位點(diǎn)的存在使得CYP17的5'翻譯區(qū)出現(xiàn)了一個(gè)額外的CCACC啟動(dòng)子位點(diǎn)，改變了CYP17基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響體內(nèi)雌激素的水平，故此多態(tài)位點(diǎn)研究較多。

目前關(guān)于CYP17基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的相關(guān)性研究未取得一致的結(jié)論。大部分研究證實(shí)C等位基因型與女性循環(huán)中高雌激素水平相關(guān)，并增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6]，但目前關(guān)于CYP17基因單核苷酸多態(tài)性與維吾爾族乳腺癌的易感性未見報(bào)道。維吾爾族乳腺癌較漢族乳腺癌有其自身的特點(diǎn)，如具有發(fā)病年齡小、妊娠次數(shù)多、月經(jīng)初潮晚、絕經(jīng)年齡小、哺乳時(shí)間長(zhǎng)、腫瘤負(fù)荷大、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多、孕激素受體陽(yáng)性率低、三陰性乳腺癌多[7]等特點(diǎn)。由此提示，遺傳易感性及單核苷酸多態(tài)性可能是上述差異的潛在原因之一。Gibson等[8]報(bào)道發(fā)現(xiàn)亞洲的菲律賓人乳腺癌的患病率較亞洲其他地區(qū)人群高，這也進(jìn)一步揭示了乳腺癌的發(fā)病是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，維、漢兩民族病例組及對(duì)照組基因型分布及等位基因頻率具有顯著差異(P<0.05)。維吾爾族含有高加索人種血統(tǒng)，其主要攜帶T等位基因，而漢族作為亞洲人種，其主要攜帶C等位基因，這與既往國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致。而本研究中，維吾爾族及漢族女性乳腺癌患者CC型基因頻率分別15.4%、33.3%，這與美國(guó)(16%)、日本(26%)有所差異[9-10]，原因可能與地域環(huán)境、研究群體的選擇、各種隨機(jī)偏差和系統(tǒng)誤差以及小樣本量等因素有關(guān)。

此外，謝偉等[11]對(duì)中國(guó)漢族女性的相關(guān)研究顯示，病例組突變基因型顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且突變基因型增加了中國(guó)漢族女性的乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Anna等[12]對(duì)波蘭羅茲地區(qū)高加索人的研究亦提示CC基因型及攜帶突變C等位基因可能增加乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。然而王麗等[13]在一份大宗的Meta分析中指出，無(wú)論CYP17基因純合突變還是雜合突變模型與女性乳腺癌的易感性均無(wú)關(guān)(P>0.05)，但該研究包含高加索人及漢族，沒(méi)有具體分析不同民族之間的差異，故可能對(duì)Meta分析的結(jié)果有一定的影響。另一項(xiàng)針對(duì)高加索人種的大型薈萃分析[14]中，共納入35項(xiàng)研究包括22 090例病例和28 498例對(duì)照進(jìn)行匯總分析，亦無(wú)證據(jù)表明CYP17 MspA1多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)生相關(guān)。本研究中比較了CYP17基因多態(tài)性與維、漢兩民族乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。其中，在維吾爾族組中，攜帶CYP17各基因型者均未顯示出增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，這與Surekha等[15]對(duì)印度高加索人群的研究結(jié)果一致。在漢族人群中，攜帶CYP17各基因型亦未顯示出增加漢族女性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，該結(jié)果與Yao等[16]對(duì)中國(guó)漢族人群該位點(diǎn)基因多態(tài)性與乳腺癌易感性的Meta分析中得出的結(jié)論一致。但本研究結(jié)果與大部分研究結(jié)果不一致，這可能是由于該基因的低外顯性及樣本量相對(duì)較小所導(dǎo)致的。

本研究?jī)H對(duì)CYP17單個(gè)基因的單個(gè)位點(diǎn)的核苷酸多態(tài)性與乳腺癌易感性進(jìn)行分析，尚不能確定是該位點(diǎn)本身或與其他位點(diǎn)多態(tài)性協(xié)同作用引起乳腺癌易感，因此，為了更加全面研究新疆維、漢女性乳腺癌的易感性，還需進(jìn)一步研究新疆維、漢人群CYP17基因不同位點(diǎn)以及參與雌激素代謝的其它酶聯(lián)合突變與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)的研究，同時(shí)還需再進(jìn)行多中心、大樣本及更多已知的乳腺癌危險(xiǎn)因子的綜合分析的研究，從而更好地服務(wù)于臨床，更好地指導(dǎo)新疆維吾爾族乳腺癌的個(gè)體化診斷及治療。

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(編輯：吳小紅)

Correlation between CYP17 Gene Polymorphism and Breast Cancer of Uygur and Han Women in Xinjiang

LIJing,GUOLi,LIYan,etal.

Objective To investigate the relationship between CYP17 rs743572 gene polymorphism and breast cancer susceptivity in Uygur and Han women.Methods Using the polymerasechain reaction-restrictive fragment length polymorphism(PCR-RFLP)method to examine the CYP17 rs743572 position spot polymorphism from 130 cases of Uygur patients with breast cancer,125 cases of Uygur normal women,120 cases of Han patients with breast cancer,and 118 cases of Han normal women,and to analyze the relationship between polymorphism at this spot and susceptivity with breast cancer.Results In the 2 groups of the Uygur and Han,the genotype distribution and allele frequency had significant difference (P<0.05).There was no significant difference between genotype distribution and allele frequencies in both groups of the Uygur and Han (P>0.05);Genotype and allele didn't increase the risk of breast cancer for both groups of the Uygur and Han.Conclusion In the 2 groups of the Uigur and Han,the genotype distribution and allele frequency have significant difference.CYP17 rs743572 polymorphism is not related to breast cancer in both Uygur and Han groups.

Breast cancer；CYP17 gene；Uygur；Han；Gene polymorphism

新疆維吾爾自治區(qū)科技廳自然科學(xué)基金(2013211A068)

830011 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

楊順娥

10.3969/j.issn.1001-5930.2015.11.003

R737.9

A

1001-5930(2015)11-1588-05

2015-04-20

2015-06-25)

TheAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi,830011