黃冬薇 張德明 譚瑞星 郭振輝

固相微萃取?氣相色譜／質(zhì)譜技術(shù)在部分腸桿菌鑒定中的應(yīng)用

黃冬薇 張德明 譚瑞星 郭振輝

目的應(yīng)用固相微萃取?氣相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME?GC／MS）檢測(cè)分析體外培養(yǎng)腸桿菌的揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs），探討SPME?GC／MS檢測(cè)應(yīng)用于腸桿菌菌種鑒別的可行性。方法取腸桿菌40株，培養(yǎng)24 h后，通過SPME?GC／MS技術(shù)收集并檢測(cè)分析細(xì)菌培養(yǎng)產(chǎn)生的VOCs。結(jié)果40株腸桿菌檢測(cè)出濃度較高的VOCs有14種，而乙酸在大腸埃希菌菌種的檢出率為100%，在其余菌種中檢出率為0，3?甲基?1?丁醇在肺炎克雷白菌種、十四烷醇酯在產(chǎn)氣腸桿菌中檢出率均為100%，在其余菌種中檢出率均為0。3?甲基?1?丁醇，乙酸、吲哚，十四烷醇酯分別為肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌的相對(duì)特異性VOCs。結(jié)論通過SPME?GC／MS技術(shù)可檢測(cè)到部分腸桿菌的特異性VOCs，將其應(yīng)用于腸桿菌菌種的鑒別具有可行性。

揮發(fā)性有機(jī)物；下呼吸道感染；固相微萃??；氣相色譜／質(zhì)譜

老年人是下呼吸道感染的主要群體，且感染患病率、病死率高，其原因與免疫和呼吸道防御功能減退、基礎(chǔ)疾病多、營(yíng)養(yǎng)狀況差、容易誤吸等因素相關(guān)，目前老年人下呼吸道感染常見的病原菌主要為革蘭陰性桿菌，其中又以肺炎克雷白菌、大腸埃希菌等腸桿菌最為常見，而早期、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷對(duì)下呼吸道感染的治療至關(guān)重要［1?2］，但目前起始抗生素治療往往缺乏可靠的病原學(xué)資料，通常為經(jīng)驗(yàn)性治療。因此，一種便捷、快速、無創(chuàng)的鑒別感染細(xì)菌菌種的方法對(duì)于抗生素準(zhǔn)確、及時(shí)的應(yīng)用有著重要的指導(dǎo)意義。近年來，有應(yīng)用氣相色譜／質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME?GC／MS）檢測(cè)患者呼出氣揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）以達(dá)到快速診斷結(jié)核菌感染的報(bào)道［3］，本研究則選取臨床下呼吸道感染常見的腸桿菌科細(xì)菌作為研究對(duì)象，通過SPME?GC／MS檢測(cè)分析體外培養(yǎng)腸桿菌VOCs，探討該技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌鑒別的可行性，并為進(jìn)一步探討SPME?GC／MS技術(shù)直接檢測(cè)下呼吸道感染患者呼出氣VOCs以鑒別感染病原菌的研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 取自我院檢驗(yàn)科微生物室的腸桿菌科菌株40株，其中大腸埃希菌12株、肺炎克雷白菌12株、陰溝腸桿菌10株、產(chǎn)氣腸桿菌6株，細(xì)菌菌株的分離和鑒定均由我院檢驗(yàn)科微生物室按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第2版）》進(jìn)行，細(xì)菌鑒定采用法國(guó)Bio?Vitek自動(dòng)化細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.2 儀器與試劑 血培養(yǎng)基；血液增菌培養(yǎng)液；0.45%鹽水（Biomerieux Inc）磁攪拌子；雙相血培養(yǎng)瓶（梅里埃公司）；恒溫恒濕箱、比濁測(cè)定儀（VITEK DENSICHEK）；SPME手柄；75μm CAR／PDMS SPME萃取頭；毛細(xì)管柱（INNOWAC 30 m×0.25 m×0.25 μm）；氣?質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Voyager GC／MS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌的增殖與培養(yǎng)：刮取所選細(xì)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，于磨菌器內(nèi)鹽水研磨呈均勻的菌液，再加鹽水稀釋，通過比濁測(cè)定儀測(cè)定后，分別制成1.0 McFar?land混懸液。在無菌操作下打開培養(yǎng)瓶蓋，將攪拌子放入其中，并在各培養(yǎng)瓶上分別標(biāo)記各個(gè)細(xì)菌菌種和空白對(duì)照。將雙相血培養(yǎng)瓶蓋酒精消毒后，先將生理鹽水3 ml注入空白對(duì)照瓶中，再用注射器取各細(xì)菌菌液3 ml注入已標(biāo)記的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，隨后將培養(yǎng)瓶放入恒溫恒濕箱中，培養(yǎng)24 h。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)瓶上層氣體的采樣濃縮：細(xì)菌培養(yǎng)液用磁力攪拌子中速攪拌，將SPME針管穿過樣品瓶頂空瓶隔墊，伸入瓶中，將纖維頭置于培養(yǎng)液上部，并在室溫下頂空式萃取30 min。

1.3.3 細(xì)菌VOCs的分離與檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)采用GC／MS方法檢測(cè)分析VOCs，吸附樣品的SPME插入氣相色譜／質(zhì)譜進(jìn)樣口進(jìn)行上樣，GC／MS條件為HP25MS石英毛細(xì)管柱；載氣為He，流速為1.0 ml／min，進(jìn)樣口溫度250℃；程序升溫：起始50℃，保持2 min，再以8℃／min升溫至180℃，再以10℃／min升溫至240℃，保持5 min；接口溫度280℃；質(zhì)譜掃描范圍35～550 u；電子能量：70 V。

1.4 數(shù)據(jù)處理 將各細(xì)菌組檢測(cè)得出的質(zhì)譜圖與空白對(duì)照的質(zhì)譜圖對(duì)比，篩選出有意義峰值，采用Wi?ley2713和Nist98譜庫(kù)進(jìn)行譜圖檢索。

2 結(jié)果

40株發(fā)酵菌共檢測(cè)出濃度較高的VOCs有14種，檢出的VOCs多為醇類及酯類物質(zhì)，其中肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌共同檢出的成分有乙醇、1?葵醇、1?十二醇、順式?9?十六碳單烯酸、1?十六醇。乙酸在大腸埃希菌菌種的檢測(cè)率為100%，在其余菌種中檢出率為0。3?甲基?1?丁醇在肺炎克雷白菌種、十四烷醇酯在產(chǎn)氣腸桿菌中檢出率均為100%，而在其余菌種中檢出率為0，見表1。

表1 各細(xì)菌VOCs檢出率（n，%）

3 討論

GC／MS檢測(cè)有著高選擇性、高分離效能、高靈敏度、高速度等特點(diǎn)，在疾病的快速診斷方面有著很大的優(yōu)勢(shì)。近年來將GC／MS應(yīng)用于疾病診斷的研究層出不窮，呼吸系統(tǒng)疾病的生化診斷長(zhǎng)期滯后于機(jī)體其他器官，對(duì)于許多無法耐受有創(chuàng)檢查的老年患者而言，無創(chuàng)、快捷的診斷方法的出現(xiàn)無疑可以提供極大的便利條件。目前通過GC／MS檢測(cè)VOCs在細(xì)菌中的應(yīng)用主要見于工業(yè)及環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，如檢測(cè)食品及土壤中的細(xì)菌、真菌的VOCs［4?5］，亦有文獻(xiàn)報(bào)道將氣相色譜法應(yīng)用于口腔、腹部厭氧菌感染的研究中［6］，2007年P(guān)hillips等［3］在肺結(jié)核患者的呼出氣中檢測(cè)到體外培養(yǎng)結(jié)核菌產(chǎn)生的特異性VOCs，應(yīng)用該特異性氣體來診斷肺結(jié)核有很好的敏感性及特異性。但將該方法應(yīng)用于其他下呼吸道感染細(xì)菌的研究國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)少有報(bào)道。

近年來通過檢測(cè)人體呼出氣VOCs來反映機(jī)體的病理、生理狀態(tài)成為研究的熱點(diǎn)。研究范圍涵蓋了慢性炎癥性疾病、惡性腫瘤、腎功能不全、器官移植排斥等疾病［7?9］。本研究以臨床常見腸桿菌為研究對(duì)象，通過SPME?GC／MS可檢測(cè)到肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌的多種VOCs，多以醇類為主，各菌間有多種共同產(chǎn)生的VOCs及相對(duì)特異性的VOCs，在同類菌屬中，各株檢出的VOCs也不盡相同，細(xì)菌代謝產(chǎn)物的重疊以及各菌的個(gè)體差異使得分辨出細(xì)菌的特異性VOCs較為困難。實(shí)驗(yàn)中可檢測(cè)到肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌的相對(duì)特異性VOCs，但由于細(xì)菌樣本量較小，檢測(cè)細(xì)菌菌種不多，尚難確定這些VOCs是否為各細(xì)菌的標(biāo)志性氣體，后期如進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并將檢測(cè)菌種增加至革蘭陽性菌、真菌等菌種，對(duì)于分析細(xì)菌的鑒別會(huì)更有意義。但SPME?GC／MS分析方法制定實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化流程較難，由于實(shí)驗(yàn)條件的局限性，并未能在多種條件下比較檢測(cè)條件的優(yōu)勢(shì)，因此仍有待進(jìn)一步探索比較。

本實(shí)驗(yàn)通過SPME?GC／MS技術(shù)可檢測(cè)出肺炎克雷白菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌的相對(duì)特異性VOCs，這些相對(duì)特異性VOCs有助于細(xì)菌的鑒別，為進(jìn)一步探討SPME?GC／MS技術(shù)直接應(yīng)用于檢測(cè)下呼吸道感染患者呼出氣VOCs的研究打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是，人呼出氣中成分較為復(fù)雜，細(xì)菌VOCs在人體呼出氣中含量極其微小，人體在感染狀態(tài)時(shí)因氧化應(yīng)激產(chǎn)生VOCs對(duì)細(xì)菌代謝物檢測(cè)也有一定的干擾，因此VOCs檢測(cè)在下呼吸道感染中的應(yīng)用仍需大量的后續(xù)研究。

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Application of solid?phase m icro?extraction and gas chromatography?mass spectrometry technique in identifying enterobacteriaceae

HUANG Dong?wei，ZHANG De?ming，TAN Rui?xing，GUO Zhen?hui．
The Third Department of Ger?ontology，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangdong Provincial Key Laboratory of Geriatric In?fection and Organ Function Support，Guangzhou 510010，China

ObjectiveTo detect the volative organic compounds（VOCs）of enterobacteriaceae cultured in vitro with solid?phase micro?extraction and gas chromatography?mass spectrometry（SPME?GC／MS）technique.MethodsForty samples of enterobacteriaceae were collected and cultured in the mycobottles for 24 hours，and the VOCs of the bacte?ria were detected and analyzed by SPME?GC／MS.ResultsFourteen main VOCs were detected from all bacteria，and the detection rate of acetic acid was 100%in escherichia coli group and 0 in other enterobacteriaceae groups.The detection rate of 1?butanol 3?methyl was 100%in klebsiella pneumoniae group and the detection rate of 1，14?Tetradecanediol was 100% in enterobacter aerogenes group，but the detection rate was 0 in other enterobacteriaceae groups.1?Butanol，3?methyl might be the specific VOCs for klebsiella pneumoniae，Acetic acid and Indole might be the specific VOCs for escherichia coli，and 1，14?Tetradecanediol for enterobacter aerogenes.ConclusionsThe specific VOCs of enterobacteria can be detected with SPME?GC／MS technique.The application of SPME?GC／MS technique in identifying enterobacteriaceae is feasible.

volative organic compounds；lower respiratory infections；solid?phase micro?extraction；gas chroma?tography?mass spectrometry

R 446.5

A

10.3969／j.issn.1003?9198.2015.01.014

2014?04?13）

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009Z1?E421）

510010廣東省廣州市，中國(guó)人民解放軍廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院干部病房三科廣東省老年感染與器官功能支持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室