鄭孟君，曹建民，郭 嫻，周海濤

（1.江南大學體育學院，江蘇無錫214000；2.北京體育大學運動人體科學學院，北京100084；3.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京100023）

補益中藥對運動性腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟炎癥因子及ECM表達的影響

鄭孟君1，曹建民2，郭 嫻2，周海濤3

（1.江南大學體育學院，江蘇無錫214000；2.北京體育大學運動人體科學學院，北京100084；3.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京100023）

觀察補益中藥對運動性腎缺血再灌注損傷大鼠腎臟炎癥因子及ECM表達的影響。方法：75只7周齡雄性Wistar大鼠隨機分為4組：安靜對照組（C組，12只）、一般訓練組（M組，12只）、過度訓練組（OM組，24只）和補益中藥＋過度訓練組（TM組，24只），M、OM、TM組進行8周56天的游泳訓練。采用專業(yè)灌胃器每天灌胃1次，TM組灌胃采用黃芪、紅景天、丹參、苦參等組成的復合中藥制劑，劑量為1 g·kg－1，體積為5 mL·kg－1，其他各組灌胃等量生理鹽水。末次訓練后24 h，采用PAS染色觀察腎小球ECM沉積情況，免疫組織化學法檢測腎組織TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－18蛋白表達，RT－PCR法檢測腎組織TNF－αmRNA、IL－1βmRNA、IL－6 mRNA、IL－18 mRNA、TGF－β1 mRNA表達。結(jié)果：1）8周實驗后，腎小球ECM沉積，C、M組間無顯著差異（P＞0.05）；OM組較C、M組顯著增加（P＜0.01）；TM組顯著低于OM組（P＜0.05）。2）血尿素氮和血清肌酐水平，OM組和TM組顯著高于C組（P＜0.01），TM組顯著低于OM組（P＜0.05）；腎組織TNF－α、IL－1β、IL－6和IL－18蛋白表達，OM組和TM組顯著高于C組（P＜0.01），TM組顯著低于OM組（P＜0.05）；腎組織TNF－αmRNA、IL－1βm RNA、IL－6 m RNA和IL－18 m RNA表達，OM、TM組顯著高于C組（P＜0.01），TM組顯著低于OM組（P＜0.05）；腎組織TGF－β1mRNA表達，TM組（P＜0.05）和OM組（P＜0.01）顯著高于C組，TM組顯著低于OM組（P＜0.05）。結(jié)論：8周過度訓練致大鼠發(fā)生運動性腎缺血再灌注，同時ECM沉積加強。補充補益中藥可通過抑制腎臟組織TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－18的表達進而減輕了過度訓練誘導腎臟缺血再灌注發(fā)生時腎臟組織TGF－β1的表達，抑制ECM的合成和（或）促進ECM的降解及組織病理學改變，延緩或避免過度訓練導致的運動性缺血再灌注對腎臟的損害。

補益中藥；運動性腎缺血再灌注損傷；炎癥因子；細胞外基質(zhì)

腎臟對缺血及缺血再灌注損傷異常敏感，運動及其恢復期腎血流量的兩個時相的改變導致了運動性腎缺血再灌注損傷（exercise－related renal ischemia－reperfusion injury，ERRIRI）的整個過程［1］。近年的研究表明：在急性腎缺血再灌注損傷中TNF－α、IL－1、IL－6、IL－18這組功能密切相關(guān)的炎癥細胞因子發(fā)揮著重要作用［2］。腎缺血再灌注損傷所導致的炎癥因子的表達可以引起腎臟固有細胞的增殖，刺激其表達粘附分子并生成過多的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），進而影響腎臟細胞外基質(zhì)代謝平衡，并直接影響到組織細胞結(jié)構(gòu)和功能的變化［3］。中醫(yī)理論認為，腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨而通于腦。腎中精氣所化生之元氣，具有推動人體生長發(fā)育，溫煦和激發(fā)人體各臟腑、經(jīng)絡等組織器官活動的作用，為人體諸氣的根本［4］。長期過度訓練導致的運動性疲勞，先耗傷脾陽，久則及腎；脾腎同為精血生化之源，陽氣之根本，脾腎耗傷，陽氣受損，精血生化不足，則導致運動的原動力不足，產(chǎn)生諸多疲勞綜合癥［5］。具有多靶點、多途徑作用且?guī)缀醪缓`禁成分優(yōu)勢的中藥，對過度訓練導致的ERRIRI的保護作用，已為運動醫(yī)學界所重視。但目前有關(guān)中藥對運動訓練與炎癥細胞因子及腎組織細胞外基質(zhì)代謝間的相互作用關(guān)系的調(diào)節(jié)功能的研究尚未見報道。故本實驗選用黃芪、紅景天、丹參、苦參等中藥材，結(jié)合前期研究適當增減組方制成復合中藥制劑，觀察其對炎性細胞因子TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－18蛋白及基因表達的影響及對腎臟ECM代謝、ECM沉積的調(diào)節(jié)作用，進而研究補益中藥對過度訓練導致的運動性腎缺血再灌注損傷的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1 動物和分組［6］

清潔級75只雄性Wistar大鼠，49 d齡，體重（196.95±11.36）g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，動物生產(chǎn)合格證編號SCXK（京）2006－ 0008。整個實驗中，實驗室溫度保持在（22±2）℃，相對濕度55%～75%，光照時間隨自然變化。大鼠以基礎飼料（北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供）和蒸餾水常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食。實驗時間為63d，正式訓練56d。動物實驗于北京體育大學運動營養(yǎng)實驗室完成。

大鼠適應性飼養(yǎng)4 d后，以20 min·d－1的運動量對其進行為期3d的篩選，淘汰個別不適應的游泳者，剔除不符合實驗要求的大鼠，剩余大鼠以數(shù)字隨機分組法分為4組：對照組（C組，12只）、一般訓練組（M組，12只）、過度訓練組（OM組，24只）和中藥＋過度訓練組（TM組，24只）。采用專業(yè)灌胃器每天灌胃一次，TM組劑量為1 g·kg－1，灌胃體積為5 m L·kg－1，其他各組灌胃等量生理鹽水。

1.2 實驗用藥

復合補益中藥制劑主要成分為黃芪、紅景天、丹參、苦參等，購自北京同仁堂，批號：120324154，并經(jīng)天津中瑞藥業(yè)有限公司高級工程師高占友鑒定。按比例稱取藥品50 g加水500 m L，浸泡30 min后煎30 min，過濾所得水煎液，再將過濾后的水煎液加水500 m L煎30 min，過濾所得水煎液。將兩次過濾的水煎液混合，濃縮至濃度1 g（生藥）·m L－1，4℃存放備用［6］。

1.3 訓練及測試方案

C組常規(guī)飼養(yǎng)，不運動，無任何干預。M組進行正式中等強度游泳訓練8周（無負重），每周6 d，每天1次，第1次下水游20 min，此后逐漸增加，至第1周末每天游60 min，第2周末加至每天游90 min，第3周末加至每天游120 min，此后5周均保持此運動量。TM組和OM組前3周訓練時間安排同M組，第4周起開始安排高強度訓練。第1～3周負0.5%體重，第4周負1%體重，第5周負2%體重，每天訓練1次。第6周負2%體重，每天上、下午各訓練1次，第7～8周，每天上午、下午、夜間各訓練1次，均負5%體重［6］。大鼠進行負重游泳，每次訓練至力竭。力竭標準以大鼠下沉后10 s不露出水面為準。

C、M組大鼠均正常生長，無意外死亡。TM組和OM組大鼠因尾部負重，疲勞、力竭不能恢復及訓練意外死亡等原因，死亡率較高。至第8周末時，TM組24只僅剩14只，OM組24只僅剩11只。

1.4 指標測定

末次游泳訓練24 h后，各組大鼠乙醚適度麻醉，頸總動脈取血，加入檸檬酸鈉溶液抗凝，37℃水浴30 min后，4℃、3 000 r／min離心10 min，分離制備血清，置－20℃冰箱中保存待查。迅速取雙腎，剔除筋膜，置于預冷的生理鹽水中洗凈血污，觀察腎臟大小、色澤、質(zhì)地，切取腎組織，分別用消毒鋁箔包好，迅速投入液氮暫存，隨后保存于－70℃冰箱凍存待測［6］。

取部分腎組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚切片，PAS染色并進行組織病理學分析。采用Jaffe苦味酸法測定血清肌酐，采用二乙酰－肟法測定血清尿素氮，采用免疫組織化學法測定檢測腎組織TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－18蛋白表達，采用RTPCR法測定腎組織TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－18、TGF－β1基因表達。以上試劑盒均由上海恒遠生物科技有限公司提供。

1.5 PAS染色切片圖像分析

PAS染色切片，在400×物鏡下采用北航圖像采集模塊軟件采集視野中同時切到尿極和血管極的腎小球（每張切片約有8～10個），隨后運用北航醫(yī)學病理圖像分析軟件描繪腎小球毛細血管拌輪廓，區(qū)分基質(zhì)和細胞成分，并測量單個腎小球平均面積及其基質(zhì)面積［18］。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 12.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行分析、處理，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差（）表示，組間差異采用方差分析，等級計數(shù)資料采用秩和檢驗分析，相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。顯著性水平為P＜0.05，非常顯著性水平為P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 腎組織PAS染色檢查結(jié)果

應用腎臟組織PAS染色切片分析腎小球ECM沉積情況。C、M組大鼠間腎小球ECM沉積無顯著差異（P＞0.05）；OM組大鼠腎小球ECM的沉積較C、M組顯著增加（P＜0.01）；TM組大鼠腎小球ECM的沉積顯著低于過度訓練組大鼠（P＜0.05）（表1和圖1）。

表1 各組大鼠腎小球ECM沉積比較

圖1 4組腎小球ECM沉積情況（PAS，×400）

2.2 血清尿素氮和肌酐

表2顯示：血清尿素氮和肌酐水平，C、M組比較無顯著性差異（P＞0.05）。TM、OM組顯著高于C組（P＜0.01）；TM組顯著低于OM組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清尿素氮和肌酐水平比較

2.3 腎組織IL－1β、IL－6、TNF－α、IL－18蛋白水平

2.3.1 IL－1β蛋白水平 表3顯示：C、M組大鼠腎臟組織IL－1β水平僅輕度表達，組間無顯著性差異（P＞0.05）。TM、OM組與C組比較有顯著性差異（P＜0.01）。OM組陽性表達較強，TM組較OM組表達減輕（P＜0.05）。

表3 各組腎組織IL－1β蛋白水平比較

2.3.2 IL－6蛋白水平 表4顯示：C、M組大鼠腎臟組織IL－6蛋白水平僅輕度表達且無顯著性差異（P＞0.05）。TM、OM組和C組比較存在顯著性差異（分別為P＜0.01，P＜0.05）。OM組陽性表達較強，TM組較之表達減輕（P＜0.05）。

表4 各組腎組織IL－6蛋白水平比較

2.3.3 TNF－α蛋白水平 表5顯示：C、M組大鼠腎臟組織TNF－α蛋白水平僅輕度表達且無顯著性差異（P＞0.05）。TM、OM組和C組比較存在顯著性差異（P＜0.05）。OM組陽性表達較強，TM組較之表達減輕（P＜0.05）。

表5 各組腎組織TNF－α蛋白水平比較

2.3.4 IL－18蛋白水平 表6顯示：C、M組大鼠腎臟組織IL－18蛋白水平僅輕度表達且無顯著性差異（P＞0.05）。TM、OM組和C組比較存在顯著性差異（P＜0.05）。OM組陽性表達較強，TM組較之表達減輕（P＜0.05）。

表6 各組腎組織IL－18蛋白水平比較

2.4 腎組織IL－1βm RNA、IL－6 m RNA、TNF－α m RNA、IL－18 m RNA相對表達量

表7顯示：C、M組間腎臟組織IL－1βm RNA、L－6 m RNA、TNF－αm RNA、IL－18 m RNA表達水平均無顯著性差異（P＞0.05），TM、OM組顯著高于C組（P＜0.01），TM組顯著低于OM組（P＜0.05）。

表7 各組腎臟組織IL－1βmRNA、IL－6 mRNA、TNF－αmRNA、IL－18 mRNA相對表達量比較

2.5 腎組織TGF－β1mRNA相對表達量

表8顯示：C、M組間腎臟組織TGF－β1mRNA表達水平無顯著性差異（P＞0.05），TM、OM組顯著高于C組（分別為P＜0.05，P＜0.01），TM組顯著低于OM組（P＜0.05）。

表8 各組腎臟組織TGF－β1mRNA相對表達量比較

3 討論

ECM是廣泛存在于細胞之間的一個動態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白構(gòu)成。ECM除對細胞發(fā)揮支持與連接作用外，在增殖、分化等多種生理過程中也發(fā)揮著重要作用。腎臟ECM產(chǎn)生增多或（和）ECM降解減少，均可導致腎組織內(nèi)ECM堆積［7］。ECM在腎間質(zhì)的過度堆積是導致腎小管間質(zhì)纖維化的直接原因［8］。ECM作為腎小球基底膜的構(gòu)成成分，在保證腎小球濾過屏障完整性中發(fā)揮重要作用。同時在保護腎小管上皮細胞結(jié)構(gòu)、功能及腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)展過程中也發(fā)揮著重要作用。常態(tài)下ECM的生成與降解處于動態(tài)平衡。但在某些病理狀態(tài)下，ECM的質(zhì)變和量變導致了細胞周圍微環(huán)境的改變，可直接影響細胞的功能和器官的形態(tài)［9］。研究表明：浸潤的炎癥細胞可以產(chǎn)生大量促炎癥介質(zhì)和促增殖因子，如TGF－β1、PDGF、IL－1、bFGF。這些可溶性介質(zhì)通過自分泌、旁分泌等多種形式介導與擴大間質(zhì)的炎癥反應，一方面加重上皮細胞的損傷，另一方面直接促進間質(zhì)纖維細胞增殖活化，促使ECM合成增多或／和抑制ECM的降解［10］。TGF－β1主要分布在腎小管間質(zhì)，是作用最強的促腎臟纖維化生長因子，可以通過誘導腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化，進而促進ECM的積聚誘導腎小管間質(zhì)纖維化［11］。TGF－β1不僅可以促進ECM的合成及抑制ECM的降解，同時它還可以以自分泌及旁分泌的方式參與腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展，是細胞肥大及ECM合成的重要介質(zhì)［12］，已成為目前公認的腎小管間質(zhì)損害過程中的關(guān)鍵因子。TGF－β1可通過以下環(huán)節(jié)引起ECM的過度積聚［13－14］。1）通過明顯增加ECM組成成分如Col－I、Col－III、Col－IV及FN的表達使膠原組織合成增加；2）通過刺激ECM受體的合成，使整合素的合成增加進而影響ECM的表達；3）通過減少基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMP）的表達以及促進纖溶酶原激活劑抑制物和影響金屬蛋白酶組織抑制劑的合成來減少ECM的降解；4）通過刺激參與ECM降解的蛋白酶的抑制因子的產(chǎn)生，包括PAI－1及組織型金屬蛋白酶抑制劑，減少ECM的降解。

已有研究表明，大負荷訓練會致使大鼠發(fā)生免疫反應，激活腎臟炎癥效應細胞。激活的效應細胞增殖、釋放炎癥介質(zhì)及細胞外基質(zhì)會對腎臟造成損害。炎癥介質(zhì)、細胞外基質(zhì)又反作用于效應細胞。炎癥細胞、炎癥介質(zhì)及細胞外基質(zhì)間的“交互應答”作用，導致并加重了缺血再灌注腎臟損害的發(fā)生和不斷進展，從而導致腎臟組織微細結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［15－16］。同時過度訓練造成大鼠腎缺血再灌注損傷時，腎臟組織TNF－α、IL－1β、IL－6、IL－18含量與肌酐和尿素氮成正相關(guān)，可以反映運動性腎缺血再灌注損傷的嚴重程度［6，17－18］。本研究結(jié)果顯示：8周的過度訓練導致大鼠血清肌酐和尿素氮水平升高；腎臟組織的相關(guān)炎癥因子的基因表達水平顯著提高，繼而引發(fā)蛋白表達上調(diào)。這些改變加劇了腎缺血再灌注損傷中腎臟組織的炎性反應，并使得促腎臟纖維化生長因子TGF－β1基因表達水平顯著提高，ECM生成增多或降解減少，進而造成ECM代謝失衡，腎組織發(fā)生明顯的病理學改變，大鼠腎臟功能受到嚴重損傷。而M組大鼠腎組織相關(guān)指標及ECM沉積變化不大，說明中等強度的訓練方式未造成血液促炎因子的變化及病理學改變，腎臟功能良好。TM組大鼠腎組織相關(guān)炎癥因子表達（P＜0.05）及TGF－β1表達（P＜0.05）顯著低于OM組大鼠；血尿素氮和肌酐水平也較OM組顯著降低（P＜0.05）；腎小球ECM的沉積顯著低于OM組大鼠（P＜0.05）。由此可認為本實驗中通過補充補益中藥抑制了過度訓練誘導的腎臟缺血再灌注發(fā)生時腎組織相關(guān)炎癥因子的過表達，進而下調(diào)腎臟組織TGF－β1表達，抑制ECM的合成和（或）促進ECM的降解及組織病理學改變，延緩了腎功能障礙的發(fā)生。其機制可能為：1）本實驗選用的補益中藥一方面具有良好的抗氧化性，另一方面可以通過提高組織內(nèi)抗氧化酶活性，降低氧自由基水平，抑制脂質(zhì)過氧化反應，改善機體氧化／抗氧化系統(tǒng)平衡調(diào)節(jié)能力，進而抑制由過度訓練引起的氧化應激增加所引發(fā)的腎臟組織細胞大量分泌炎性細胞因子［19－24］。2）黃芪可抑制TGF－β1誘導的HK－2細胞ECM的分泌，同時通過PAI－1途徑增加ECM的降解，使FN減少［25－27］。此外，黃芪還可降低ECM的主要成分Col－I、Col－III、Col－IV及FN的表達的合成，防止ECM的積聚［26，28－29］。3）紅景天中的主要物質(zhì)紅景天苷可以抑制ECM合成。主要通過以下途徑：①紅景天苷可以通過下調(diào)HIF－1a及TGF－β1的表達、改善細胞缺氧狀態(tài)進而抑制ECM成分的合成［30－31］。②紅景天苷可以下調(diào)節(jié)大鼠腎組織PAI－1，上調(diào)MMP－2，MMP－9水平，減少ECM成分的積聚。③紅景天苷可以通過抑制FN、LN的表達，抑制ECM的合成，減少EMC在腎小球中的積聚，促進腎臟病理損害的修復［32］。4）丹參通過抑制血管緊張素Ⅱ誘導的系膜細胞PAI－1表達，和通過調(diào)控因血管緊張素Ⅱ的刺激誘導的系膜細胞分泌增加的TGF－β1與增高的細胞內(nèi)ROS水平而實現(xiàn)抑制ECM的合成，減少EMC在腎小球中的積聚，促進腎臟病理損害的修復［33］。

4 結(jié)論

補充補益中藥可通過抑制腎臟組織中炎癥因子的表達，進而減輕了過度訓練誘導的腎臟缺血再灌注發(fā)生時腎臟組織TGF－β1的表達，抑制ECM的合成和（或）促進ECM的降解及組織病理學改變，延緩或避免過度訓練導致的運動性缺血再灌注對腎臟的損害。

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責任編輯：郭長壽

Effect of Tonic Medicine on Kidney Inflammation Factors and ECM Expression in Rats of Exercise－related Renal Ischemia－reperfusion Injuries

ZHENG Mengjun1，CAO Jianmin2，GUO Xian2，ZHOU Haitao3
（1.Sports College，Jiangnan University，Wuxi 214000，Jiangsu，China；2.Sport Science College of Beijing Sport University，Beijing 100084，China；3.Biochemical Engineering College of Beijing Union University，Beijing 100023，China）

Objective：To study the protective effects of tonic medicine on kidney inflammation factors and extracellular matrix（ECM）expression in rats of exercise－related renal ischemia－reperfusion injuries.Methods：75 male Wistar rats at the age of 7 weeks were divided into 4 groups randomly：control group（C group，n＝12），general training group（M group，n＝12），overtraining group（OM group，n＝24），tonic medicine＋overtraining group（TM group，n＝24），the Rats in M，OM，TM groups were assigned to 8 weeks of swimming training，7 days a week.Professional gavage were given once a day.The Rats of TM group were given with compound Chinese herbal medicine（The primary elements were Chinese drugs for invigoration，such as Astragalus，Rhodiola rosea，Salviae miltiorrhizae，Sophora flavescens），gavages（ig）dose was 1 g·kg－1；ig volume was 5 m L·kg－1，and other groups were given the normal saline.24 hours after the last training，we observed the glomerular ECM deposition by the PAS stain；detected the renal tissue of TNF－α，IL－1β，IL－6，IL－18 protein by immunohistochemistry and detected the expression of TNF－αm RNA，IL－1βm RNA，IL－6 mRNA，IL－18 m RNA，TGF－β1 m RNA gene in renal tissue by RT－PCR method.Results：1）8 weeks after the experiment，the glomerular ECM deposition of Cgroup and Mgroup appeared normal and showed no differences（P＞0.05）；OM group was significantly higher than that in Cgroup and Mgroup（P＜0.01），TM group was significantly lower than that of group OM（P＜0.05）.2）OM group and TM group blood urea nitrogen and serum creatinine weresignificantly higher than that of Cgroup（P＜0.01），TM group was significantly lower than that of group OM（P＜0.05）；the expression of renal TNF－α，IL－1β，IL－6 and IL－18 protein in OM group and TM group was significantly higher than that in Cgroup（P＜0.01），TM group was significantly lower than that of group OM（P＜0.05）；the expression of renal TNF－αm RNA，IL－1βm RNA，IL－6 and IL－18 m RNA in TM group and OM group was significantly higher than that of Cgroup（P＜0.01），TM group was lower than of OM group（P＜0.05）；the expression of renal TGF－β1m RNA in TM group and OM group was significantly higher than that of Cgroup（TM，P＜0.05；OM，P＜0.01），TM group was significantly lower than of OM group（P＜0.05）.Conclusion：8 weeks overtraining caused the movement of rat renal ischemia reperfusion and increased the deposition of ECM.Tonic medicine can restrain the expression of renal tissue TGF－β1 during exercise－related renal ischemia－reperfusion injury induced by overtraining，which may be achieved by inhibiting the expression of IL－1，TNF－α，IL－6，IL－18 in renal tissue.Finally it decreased the synthetic and increased the decomposition of ECM，reduced the damage and the histopathological changes，as a result，Tonic medicine can protect the rats from exercise－related renal ischemia－reperfusion injury.

tonic medicine；exercise－related renal ischemia－reperfusion injury；inflammation factors；extracellular matrix

G804.7

A

1004－0560（2015）03－0068－06

2015－03－04；

2015－03－29

國家體育總局課題（2013A101）。

鄭孟君（1980—），女，講師，碩士，主要研究方向為體育教學與運動訓練。

周海濤（1976—），男，副教授，碩士，主要研究方向為運動性疲勞與恢復。