楊 麗，鄭鵬遠(yuǎn)，于 泳

（1.鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南鄭州 450002;2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科，河南鄭州 450002）

CRF2受體拮抗劑Astressin2B減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎

楊 麗1，鄭鵬遠(yuǎn)2*，于 泳2

（1.鄭州人民醫(yī)院消化內(nèi)科，河南鄭州 450002;2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化科，河南鄭州 450002）

*通信作者（corresponding author）:mdep7123@126.com

炎性腸病的研究多集中在遺傳、免疫及微生物等方面，近年發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽也參與該病發(fā)生，其中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotrophin-releasing factor，CRF）不僅在腦組織中存在，周圍組織也有表達(dá)，后者與炎性反應(yīng)發(fā)生有關(guān)［1］，潰瘍性結(jié)腸炎腸道炎性組織中CRF的表達(dá)增高，CRF基因敲除小鼠或CRF2受體缺陷小鼠腸道炎性反應(yīng)減輕［2］，提示周圍型CRF信號(hào)系統(tǒng)活化與腸道炎性的發(fā)生有關(guān)，Astressin2B是一選擇性的CRF2受體拮抗劑，因其不通過血-腦脊液屏障，可以保證其對(duì)腸黏膜的局部作用，而不影響中樞組織的CRF2受體，本實(shí)驗(yàn)觀察Astressin2B對(duì)腸道炎性反應(yīng)改善作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)Balb/C小鼠，雌性，6～7周齡，15～18 g［鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)scxk（豫）2005-0001］，兔抗鼠 TLR4、NF-κBp65 多克隆抗體（Santa 公司），葡聚糖硫酸鈉（DSS）和 Astressin2B（Sigma公司）;TNF-α、IL-1β和IL-6ELISA試劑盒（上海西唐生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備:實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、DSS組和Astressin2B組，每組8只。建立DSS結(jié)腸炎小鼠模型，給DSS組和Astressin2B組小鼠每日飲用5%DSS（W/W）溶液，共7 d。Astressin2B組小鼠每日按30 μg/kg皮下注射Astressin2B。

1.2.2 DSS結(jié)腸炎評(píng)價(jià):每日觀察小鼠的體質(zhì)量、大便性狀和隱血情況，對(duì)小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）進(jìn)行評(píng)估。7 d后觀察結(jié)腸大體形態(tài)，對(duì)結(jié)腸大體形態(tài)評(píng)分（gross morphological score，GMS）和組織學(xué)評(píng)分（histological score，HS）。

1.2.3 比色法測(cè)定結(jié)腸組織髓過氧化物酶（MPO）。

1.2.4 Western blot檢測(cè) TLR4 和 NF-κB P65。

1.2.5 ELISA檢測(cè)組織上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠DAI評(píng)分:DSS組小鼠出現(xiàn)不同程度的懶動(dòng)、厭食、豎毛、消瘦、腹瀉和便血，與DSS組比較，Astressin2B組小鼠癥狀明顯減輕（圖1），DAI評(píng)分見圖2。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化Fig 1 Weight change of mice in each group

圖2 各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)Fig 2 The disease activity index of mice in each group

2.2 各組小鼠大體評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分及MPO活性:DSS組小鼠腸黏膜組織可見充血、水腫、散在糜爛和潰瘍，鏡下見隱窩炎，腺體排列紊亂變形，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)密集。而Astressin2B組小鼠腸黏膜炎性反應(yīng)程度較DSS組明顯輕微;MPO活性也下降（圖3和表1）。

2.3 Western blot結(jié)果測(cè)定（圖4和表1）。

圖3 各組小鼠腸黏膜組織學(xué)變化Fig 3 Histological change of mice colon in each group（×200）

表1 各組小鼠大體和組織學(xué)評(píng)分、MPO活性、炎性因子、TLR4和NF-κB測(cè)定Table 1 The value of general form score，histological score，activity of MPO，TLR4 and NF-κB in each group（x ± s，n=8）

圖4 各組小鼠腸組織中TLR4和NF-κB的蛋白表達(dá)Fig 4 The protein expressions of TLR4 and NF-κ B in mice colon in each group

2.4 ELISA檢測(cè)結(jié)果見表1。

3 討論

周圍組織中的CRF致炎作用已逐漸引起人們的注意，控制周圍組織中的CRF信號(hào)系統(tǒng)活化有可能成為減輕炎性反應(yīng)的新靶標(biāo)。本研究前期體外發(fā)現(xiàn)在腸上皮細(xì)胞中CRF通過CRF2受體通路激活TLR4信號(hào)系統(tǒng)［3］。因此擬通過類似人類潰瘍性結(jié)腸炎的DSS結(jié)腸炎模型，觀察體內(nèi)能否通過Astressin2B阻斷CRF2受體信號(hào)通路，減少CRF活化來減輕腸道炎性反應(yīng)。本結(jié)果顯示Astressin2B組小鼠質(zhì)量變化、DAI評(píng)分、大體評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分雖高于正常組，但是較之DSS組明顯降低;反映結(jié)腸炎性反應(yīng)程度的MPO的活性在Astressin2B組雖高于正常對(duì)照組，但較DSS組也明顯降低。提示在DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的過程中Astressin2B能有效的減輕腸道炎性反應(yīng)。

為了明確Astressin2B減輕腸道炎性反應(yīng)的機(jī)制，進(jìn)一步檢測(cè)了TLR4和NF-κB的表達(dá)情況。腸黏膜對(duì)腔內(nèi)微生物的免疫穩(wěn)定與腸黏膜組織中的Toll樣受體（TLR）密不可分，其中TLR4是調(diào)節(jié)這種免疫平衡最重要的受體，TLR4活化可導(dǎo)致腸黏膜對(duì)腔內(nèi)微生物異常反應(yīng)，激活NF-κB信號(hào)系統(tǒng)，導(dǎo)致大量促炎因子的釋放，進(jìn)而引起腸黏膜損傷，也是炎癥性腸病發(fā)病的一個(gè)重要原因［4］。

本研究顯示Astressin2B組中的TLR4及NF-κB表達(dá)明顯低于DSS組，TNF-α、IL-1β和 IL-6亦明顯低于 DSS組。這就提示Astressin2B對(duì)DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的保護(hù)作用可能與體內(nèi)阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減少促炎因子TNF-α、IL-1β和 IL-6的釋放有關(guān)。

［1］ Papathanasiou E，Palaska I.Theoharides TC.Stress hormones regulate periodontal inflammation.［J］.Biol Regul Homeost Agents，2013;27:621-626.

［2］Kokkotou E，Torres D，Moss AC，et al.Corticotropin-releasing hormone receptor 2-deficient mice have reduced intestinal inflammatory responses.［J］.J Immunol，2006，177:3355-3361.

［3］楊麗，鄭鵬遠(yuǎn)、劉志強(qiáng)、等，促腎上腺皮質(zhì)釋放因子對(duì)HT-29細(xì)胞中 Toll樣受體4/核因子-κB信號(hào)通路的影響［J］.中華消化雜志，2011，09:609-612.

［4］Geremia A，Biancheri P，Allan P，et al.Innate and adaptive immunity in inflammatory bowel disease.［J］.Autoimmun Rev，2014;13:3-10.

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A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.027

1001-6325（2015）09-1264-03

2015-01-06

2015-04-28

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