武 革，吳美芬，鄭坤杰，方 爍，陳曉銘

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東湛江 524001）

利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡及PDX-1表達(dá)的影響

武 革*，吳美芬，鄭坤杰，方 爍，陳曉銘

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東湛江 524001）

*通信作者（corresponding author）:wuge427@aliyun.com

胰腺十二指腸同源基因1（PDX-1）的活化被認(rèn)為是胰島素分泌和葡萄糖代謝的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［1］，PDX-1受胰高糖素樣肽-1（GLP-1）的調(diào)節(jié)。然而以往及我們的臨床研究顯示，初發(fā)及長(zhǎng)病程2型糖尿病患者血GLP-1的水平均下降并呈現(xiàn)不同程度的胰腺β細(xì)胞功能受損［2］。故本研究擬通過(guò)2型糖尿病大鼠模型，觀察利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡、再生及對(duì)PDX-1基因表達(dá)的影響，初探藥物對(duì)胰島β細(xì)胞保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為:對(duì)照組（NC），糖尿病組:［腹腔注射STZ 30 mg/（kg·BW）］及復(fù)制糖尿病模型，利拉魯肽干預(yù)組:成模后予利拉魯肽200 μg/kg每天早晚皮下注射。每組各15只共4周。

1.2 主要試劑、藥物及引物:RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）;18sRNA和PDX-1引物由南京金斯瑞公司合成;原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Roche公司）;利拉魯肽購(gòu)于諾和諾德（中國(guó)）制藥有限公司。

1.3 胰腺組織INS、PCNA免疫組織化學(xué)染色:陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色或棕褐色顆粒分布。每例標(biāo)本選擇5個(gè)視野，各數(shù)200個(gè)胰島細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比后取平均值。陰性表達(dá):不表達(dá)或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于10%;陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)大于10%為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 TUNEL檢測(cè)胰島細(xì)胞凋亡:按試劑盒說(shuō)明操作。β細(xì)胞凋亡率=每個(gè)視野β細(xì)胞凋亡數(shù)÷該視野中β細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 Real-time RT-PCR法檢測(cè)大鼠胰腺PDX-1mRNA表達(dá):提取總RNA，合成cRNA，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察。PDX-1mRNA水平以靶基因與β-actin比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胰島細(xì)胞INS、PCNA的表達(dá):INS在胰島細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃或棕褐色顆粒。PCNA是細(xì)胞增殖活性的重要指標(biāo)。糖尿病組胰腺組織INS、PCNA表達(dá)與NC及GLP-1組相比均明顯降低（與NC組、GLP-1組相比P＜0.01），利拉魯肽干預(yù)后INS、PCNA陽(yáng)性表達(dá)均較NC組回升（圖1，2）。

2.2 各組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡率比較:與對(duì)照組比較，糖尿病組胰島β細(xì)胞凋亡率明顯增高（P＜0.001），利拉魯肽干預(yù)后凋亡率降低（P＜0.001）（表1）。

2.3 各組大鼠胰腺PDX-1 mRNA的表達(dá):糖尿病組PDX-1mRNA的表達(dá)量明顯降低（P＜0.001），利拉魯肽干預(yù)后PDX-1mRNA的表達(dá)量顯著增高（較糖尿病組P＜0.001）（圖3）。

3 討論

2型糖尿病患者β細(xì)胞數(shù)量的減少，是由于β細(xì)胞凋亡增加。本實(shí)驗(yàn)中糖尿病大鼠胰島體積縮小，胰島形狀、結(jié)構(gòu)不清，胰島細(xì)胞INS、PCNA及PDX-1的表達(dá)減少，并見(jiàn)較多凋亡細(xì)胞。利拉魯肽治療后，大鼠胰島細(xì)胞INS、PCNA及PDX-1基因表達(dá)增加，胰島凋亡細(xì)胞減少。實(shí)驗(yàn)表明，利拉魯肽的治療即對(duì)抗了糖脂毒性的不良效應(yīng)，其對(duì)大鼠胰腺PDX-1基因的上調(diào)直接抑制了胰島β細(xì)胞的凋亡，可能是對(duì)胰島β細(xì)胞起保護(hù)作用的主要機(jī)制。

PDX-1是胰腺發(fā)育重要的轉(zhuǎn)錄因子，維持胰島β細(xì)胞分泌的正常功能。新的研究顯示［3］，在db/db小鼠利拉魯肽對(duì)促增殖基因PDX-1，MafA和GLP-1受體表達(dá)的促進(jìn)改善了胰島分泌功能，而早期治療較晚期治療的作用更為明顯。結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)都表明，PDX-1對(duì)GLP-1促進(jìn)胰島素分泌的增殖和再生有重要的作用，并存在內(nèi)在的關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2型糖尿病大鼠PDX-1基因表達(dá)受損，利拉魯肽對(duì)β細(xì)胞的存活、增殖顯示出不同程度的保護(hù)作用，尤其對(duì)胰腺PDX-1基因活性的上調(diào)有促進(jìn)影響。

圖1 三組大鼠胰腺INS、PCNA免疫組化染色變化Fig 1 Immunohistochemistry stain of INS，PCNA in pancreas of 3 group mice（×200）

圖2 三組大鼠胰腺INS、PCNA表達(dá)的陽(yáng)性率Fig 2 Expression of insulin and PCNA in 3 group mice

圖3 三組大鼠胰腺組織PDX-1 mRNA的表達(dá)量比較Fig 3 Expression of PDX-1 mRNA in 3group mice

表1 各組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡率比較Table 1 Apoptosis rate of β-cell in SD mice（±s，%，n=15）

表1 各組大鼠胰島β細(xì)胞凋亡率比較Table 1 Apoptosis rate of β-cell in SD mice（±s，%，n=15）

*P＜0.001 compared with NC;#P＜0.001 compared with type2 diabetes group.

group apoptosis control 9.12±1.20 type2 diabetes 41.43±3.24*GLP-1 19.53±1.52*#

［1］ Kaneto H，Miyatsuka T，Kawamori D，et al.PDX-1 and MafA play a crucial role in pancreatic beta-cell differentiation and maintenance of mature beta-cell function［J］.Endocr J，2008，55:235-252.

［2］武革，蔡曉玲，陳曉銘，等.2型糖尿病患者血GLP-1水平變化與胰島β細(xì)胞功能的關(guān)系［J］.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，32:17-20.

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R587.1

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.022

1001-6325（2015）09-1256-03

2014-09-05

2015-04-07

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B031800231）;廣東省醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（B2011243）;湛江市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B01099）

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