喻妙梅，羅光華，俞天虹，于 洋

（蘇州大學附屬第三醫(yī)院綜合實驗室，江蘇常州 213003）

hsa-miR-10b在3株宮頸癌細胞系中的表達及靶基因預測

喻妙梅，羅光華*，俞天虹，于 洋

（蘇州大學附屬第三醫(yī)院綜合實驗室，江蘇常州 213003）

目的 分析3株宮頸癌細胞系中hsa-miR-10b表達水平，并預測hsa-miR-10b的靶基因。方法 用PCR技術檢測3株宮頸癌細胞系中hsa-miR-10b表達水平;PubMed檢索hsa-miR-10b相關文獻;miRbase和NCBI分析其序列保守性及所在基因組特征;TargetScan、PicTar及miRanda數(shù)據(jù)庫預測其靶基因，并結合已證實的靶基因對其進行功能和信號通路富集分析。結果 與C-33A相比，HeLa和CaSki中hsa-miR-10b表達水平顯著下調（P＜0.01）;hsa-miR-10b與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關;hsa-miR-10b定位于人染色體2q31.1，在各物種之間具有高度保守性;其靶基因主要參與轉錄、基因表達調控和細胞增殖等生物學過程（P＜0.05），涉及腫瘤、細胞周期和ARF等信號通路（P＜0.05）。結論 hsa-miR-10b功能廣泛，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，靶基因的預測為后續(xù)研究提供依據(jù)。

生物信息學;microRNA;hsa-miR-10b;靶基因預測

*通信作者（corresponding author）:shineroar@163.com

MicroRNAs（miRNAs）是一類內源性非編碼單鏈小分子RNAs，長度為18～24 nt，廣泛存在于真核生物中［1］。目前已證實其參與調控細胞增殖、時序發(fā)育和細胞凋亡等生理過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關［2］。由于miRNAs的調控方式具有“一對多”和“多對一”的復雜網(wǎng)絡化特征，使得對miRNAs具體作用機制的認識較為局限。因此，采用生物信息學方法預測并鑒定miRNAs靶基因，對后續(xù)機制研究具有重要意義。

目前，人類miR-10的基因序列已經(jīng)測序成功，研究較多的是miR-10a和miR-10b。hsa-miR-10b在宮頸癌與癌旁組織中差異表達，且人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）陽性與陰性的宮頸癌組織中hsa-miR-10b存在顯著差異［3］。本研究通過生物信息學預測hsa-miR-10b的靶基因，對其靶基因進行功能和信號通路富集分析，為研究其在宮頸癌細胞中生物學功能及機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細胞系 C-33A（HPV陰性）、HeLa（HPV-18陽性）及CaSki（HPV-16/18陽性）（中科院上海細胞庫）。用含10%胎牛血清（Gibco公司）的MEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)C-33A和HeLa細胞，而CaSki用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）培養(yǎng)。采用miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（Tiangen公司）分別進行RNA提取、cDNA反轉錄及PCR檢測。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測miR-10b表達:按照試劑盒說明書分別提取細胞總miRNA、反轉錄cDNA。Real-Time PCR檢測的反應條件:94℃2 min，94℃ 20 s及60℃ 34 s，共40個循環(huán)。每組設6個復孔，以U6為內參來校正PCR模板的拷貝數(shù)，消除組間的加樣量誤差，重復3次?；蛳鄬Ρ磉_量采用 2－ΔΔCt方法計算。

1.2.2 文獻檢索分析:用PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）等工具檢索并查閱已發(fā)表的hsa-miR-10b相關文獻，并進行分析總結。

1.2.3 hsa-miR-10b基因分析:用miRbase（http://www.mirbase.org/index.shtml）、NCBI Map Viewer（http://w ww.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/）等在線工具獲取hsa-miR-10b堿基序列、基因定位和物種保守性等基本信息。

1.2.4 靶基因預測:用 TargetScan 6.2（http://www.targetscan.org/）、PicTar（http://pictar.mdc-ber lin.de/）及 miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）靶基因預測網(wǎng)站預測hsa-miR-10b的靶基因，并且取其三者預測結果的交集。

1.2.5 基因本體論分析:綜合各預測網(wǎng)站hsa-miR-10b靶基因交集，根據(jù)基因本體論（gene ontology，GO）注釋中的分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）和細胞組分（cellular component，CC）進行GO注釋層次分類及富集分析。GO分析采用Cytoscape（http://www.cytoscape.org/）及其插件生物網(wǎng)絡基因本體論工具（BiNGO）對靶基因進行功能富集分析（P＜0.05）。

1.2.6 通路富集分析:用DAVID數(shù)據(jù)庫（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）對 hsa-miR-10b 預測的靶基因集合進行基于京都基因與基因組百科全書KEGG（http://www.genome.jp/）和 Biocarta（http://www.biocarta.com/）兩個數(shù)據(jù)庫的生物通路富集分析。采用Fisher精確檢驗計算P值，以P＜0.05為顯著性閾值得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計意義的信號傳導及疾病通路。

2 結果

2.1 不同宮頸癌細胞系中hsa-miR-10b表達差異

與HPV陰性宮頸癌細胞系C-33A相比，HPV陽性宮頸癌細胞系HeLa和CaSki中hsa-miR-10b表達水平顯著下調（P＜0.01）（圖1）。

圖1 3株宮頸癌細胞系中hsa-miR-10b表達水平Fig 1 Expression levels of hsa-miR-10b in three cervical cancer cell lines（x ± s，n=6）

2.2 hsa-miR-10b相關文獻分析結果

研究表明hsa-miR-10b在多種腫瘤中異常表達，如乳腺癌、膠質瘤、食道癌、膀胱癌、胃癌、鼻咽癌、肝癌、非小細胞性肺癌和胰腺癌等（表1）。

2.3 hsa-miR-10b同源性分析結果

分析結果顯示 hsa-miR-10b位于人染色體2q31.1（chr2:176150303－17615041 2），且 miR-10b中“UACCCUGUAGAACCGAAUUUGU”這22個堿基序列在各物種間具有高度保守性（表2）。

2.4 hsa-miR-10b靶基因預測結果

TargetScan 6.2、PicTar及 miRanda數(shù)據(jù)庫檢索預測hsa-miR-10b的靶基因分別有271、193、7 048個，其中miRanda預測結果中具有物種保守的靶基因2 761個;取三者預測靶基因交集55個，合并文獻已報道但未在預測交集中的靶基因9個:HOXD10、KLF4、TIAM1、TIP30、MMP2、MMP9、CDKN2A、GATA3及MDM2［13］，共 64 個（表 3）。

2.5 hsa-miR-10b靶基因集合的GO功能富集分析結果

hsa-miR-10b靶基因功能主要涉及轉錄、RNA生物合成和代謝過程、生物大分子代謝過程、基因表達調控、細胞增殖和胚胎發(fā)育等生物學過程（P＜0.05）（表4）。

2.6 hsa-miR-10b Pathway富集分析結果

經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫KEGG中hsa-miR-10b預測靶基因集合顯著富集于2個信號傳導通路（腫瘤信號通路、細胞周期）和4個疾病通路（膀胱癌、膠質瘤、慢性粒細胞白血病、黑色素瘤）（P＜0.05）;而在Biocarta通路數(shù)據(jù)庫中，基因集合顯著富集在ARF、CTCF和VEGF3個信號傳導通路中（圖2）（P＜0.05）。

表1 已有文獻支持的部分hsa-miR-10b功能Table 1 The partial function of hsa-miR-10b surpported by the relative studies

表2 部分物種miR-10b保守序列Table 2 Conserved sequence of miR-10b among partial species

表3 預測的hsa-miR-10b靶標基因集合Table 3 The predicted target genes of hsa-miR-10b

表4 hsa-miR-10b靶基因集合的GO功能富集分析結果Table 4 GO enrichment analysis of the target genes of hsa-miR-10b

續(xù)表4

圖2 hsa-miR-10b靶基因集合的Pathway通路富集分析Fig 2 Pathway enrichment analysis of the target genes of hsa-miR-10b

3 討論

近年來，miRNAs與腫瘤的相關性研究已成為熱點。本研究PCR結果顯示HPV陽性與HPV陰性宮頸癌細胞系相比hsa-miR-10b表達水平顯著下調，而HPV是導致宮頸癌發(fā)生的必要因素，90%以上的宮頸癌伴有高危型HPV感染［14］。因此，這一結果提示hsa-miR-10b可能與HPV感染有關，且可能在HPV感染相關宮頸癌發(fā)生過程中發(fā)揮作用，這對闡明HPV致癌機制和尋找宮頸癌潛在的分子標志物具有重要的意義。

已有研究表明hsa-miR-10b的表達具有組織特異性，既可以通過負性調控靶基因的表達發(fā)揮原癌基因的作用，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，也可以抑制靶基因表達發(fā)揮抑癌作用。有文獻報道宮頸癌患者癌組織與癌旁組織相比miR-10b的表達顯著下調，但機制尚不清楚［3］。這一結果提示hsa-miR-10b在宮頸癌中可能通過負性調控靶基因抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。

本研究分析發(fā)現(xiàn)miR-10b序列在多種物種間高度保守，提示其可能具有較大生物學功能。采用TargetScan、PicTar和 miRanda 3種常用的 miRNAs靶基因預測工具進行預測，并取其交集，可提高預測結果的可靠性，有效降低假陽性率。

GO功能和信號通路富集結果顯示，hsa-miR-10b靶基因涉及轉錄、基因表達調控、細胞增殖和胚胎發(fā)育等生物學過程，并顯著富集于膀胱癌、膠質瘤、慢性粒細胞白血病、黑色素瘤、細胞周期、ARF、CTCF和VEGF信號通路。ARF、CTCF和VEGF信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。分析結果表明，hsa-miR-10b靶基因顯著富集在多個腫瘤通路和與腫瘤發(fā)生相關的信號通路中，提示hsamiR-10b可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的調控，且可能通過調節(jié)腫瘤細胞增殖、周期和代謝等影響腫瘤的進程。目前已有的hsa-miR-10b與腫瘤的研究尚未涉及慢性粒細胞白血病和黑色素瘤，提示相關研究值得探討。

綜上所述，通過生物信息學預測hsa-miR-10b的靶基因，并對其靶基因進行功能和信號通路富集分析，對后續(xù)研究其在宮頸癌細胞中生物學功能及機制有重要意義。

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Expression of hsa-miR-10b in three cervical cancer cell lines and its target genes

YU Miao-mei，LUO Guang-hua*，YU Tian-hong，YU Yang

（Comprehensive Laboratory，the Third Affiliated Hospital of Soochow University，Changzhou 213003，China）

ObjectiveTo analyze the expression of hsa-miR-10b in three cervical cancer cell lines，and to find the target genes of hsa-miR-10b.MethodsPCR was applied to measure expression levels of hsa-miR-10b in C-33A，HeLa and CaSki.The relative studies on hsa-miR-10b were retrieved from PubMed.The sequence and genome characteristics of hsa-miR-10b were analyzed on line by miRbase and NCBI.The target genes of hsa-miR-10b were searched by TargetScan，PicTar and miRanda，and then demonstrated by Gene Ontology and Pathway Enrichment analysis.ResultsCompared with C-33A，the expression of hsa-miR-10b significantly reduced in HeLa and Caski（P＜0.01）.Current studies showed that hsa-miR-10b was related with multiple tumorigenesis.hsa-miR-10b was located in human chromosome 2q31.1 and highly conserved among different species.The target genes were enriched in the biological processes of transcription，gene expression regulation，cell proliferation and etc.（P＜0.05）.Pathway analysis showed that these target genes were responsible for biochemical erents mediated by to the signaling pathways of cancer，cell cycle，ARF and etc.（P＜ 0.05）.Conclusionshsa-miR-10b may have extensive functions，and closely related with the occurrence and development in cervical cancer.Prediction of target genes provides a theoretical basis for the further study.

bioinformatics;microRNA;hsa-miR-10b;target gene prediction

R73-3

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.018

1001-6325（2015）09-1237-06

2015-04-13

2015-05-25

book=1242,ebook=343