趙 嵐，董銀華，王洪新，梁佩芬

（天津市第四中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300140）

糖調(diào)節(jié)受損大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)

趙 嵐，董銀華，王洪新*，梁佩芬

（天津市第四中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300140）

目的 探討糖調(diào)節(jié)受損大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡與學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)系。方法 用高脂高糖飼料飼養(yǎng)法建立糖調(diào)節(jié)受損大鼠模型;用Morris水迷宮法檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力;用TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目;用免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2/Bax和Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與NGT組相比，IGR組學(xué)習(xí)記憶能力下降（P＜0.05），海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)增高（P＜0.05），Bcl-2、Bcl-2 mRNA表達(dá)減少（P＜0.05），Bax與Bax mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）。IGR組學(xué)習(xí)、記憶能力與Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05），與Bax陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論 糖調(diào)節(jié)受損與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降有相關(guān)性，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是其重要機(jī)制之一。

糖調(diào)節(jié)受損;學(xué)習(xí)記憶;神經(jīng)細(xì)胞凋亡;海馬

隨著人們生活水平的提高，糖尿病患者逐年增加。糖尿病腦病作為糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶能力及解決問(wèn)題能力的下降。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于糖尿病腦病的研究較多，血糖增高誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)引起中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡可能是其發(fā)病機(jī)制之一［1］。糖調(diào)節(jié)受損是糖尿病的前期狀態(tài)，約1/3患者會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)樘悄虿?。糖調(diào)節(jié)受損作是否會(huì)導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)記憶能力下降，目前尚無(wú)明確報(bào)道。本研究通過(guò)建立糖調(diào)節(jié)受損大鼠模型，從凋亡機(jī)制角度探討糖調(diào)節(jié)受損與學(xué)習(xí)記憶減退的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g［天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SYXK（津）2009-0001］;高脂高糖飼料（豬油10%，膽固醇1.2%，膽鹽0.2%，果糖15%，蛋黃粉10%，余為基礎(chǔ)飼料）;末梢血糖儀及試紙、TUNEL檢測(cè)試劑盒（羅氏公司）;Morris水迷宮及水迷宮記錄分析系統(tǒng)（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制）;免疫組化和原位雜交試劑盒（武漢博士德公司）;DAB顯色劑（北京中山公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備:Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成對(duì)照組（NGT組）和糖調(diào)節(jié)受損組（IGR組），每組40只。實(shí)驗(yàn)組給予高脂高糖飼料。兩組大鼠每日均喂食3次，按每只20 g/日投放飼料，共飼養(yǎng)20周。從第5周開(kāi)始，每?jī)芍苓M(jìn)行1次葡萄糖耐量試驗(yàn)［2］。糖調(diào)節(jié)受損大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖6.2～7.5 mmol/L或者餐后2 h血糖7.9～10.4 mmol/L［3］。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè):NGT組和IGR組分別于飼養(yǎng)5、10、15 和20 周，用 Morris水迷宮法［4］對(duì)大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶功能測(cè)定。第1天至第4天記錄大鼠在水池內(nèi)任一入水點(diǎn)返回隱藏平臺(tái)所需時(shí)間（隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)），作為學(xué)習(xí)成績(jī);第5天撤去隱藏平臺(tái)后，記錄大鼠在水池任一位置入水后2 min內(nèi)通過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)（空間搜索實(shí)驗(yàn)），作為記憶成績(jī)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)訓(xùn)練10只大鼠。

1.2.3 大鼠腦組織石蠟切片:大鼠海馬組織石蠟包埋后切片，厚度5 μm。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取10只大鼠，為相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)的大鼠。具體步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)［5］。

1.2.4 原位末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目:嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提示步驟進(jìn)行操作。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞為在顯微鏡下觀察細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者。陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞定量采用Imane-Proplus軟件系統(tǒng)，每只大鼠取海馬平面切片中相互不重疊的5個(gè)視野，在400倍視野下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞平均個(gè)數(shù)。

1.2.5 免疫組化法和原位雜交法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中Bcl-2/Bax和Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的表達(dá):操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。顯微鏡下觀察所有染色切片，陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志為組織切片中胞核或胞質(zhì)染黃色或黃棕色者。每張切片在顯微鏡200倍視野下選5個(gè)互不重疊視野，以平均吸光度值反映表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2/Bax陽(yáng)性表達(dá)及認(rèn)知功能進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 糖調(diào)節(jié)大鼠成模情況

IGR組大鼠成模率于12周時(shí)為60%，15周時(shí)為100%。

2.2 一般觀察

與NGT組相比，IGR組大鼠飼養(yǎng)15周和20周時(shí)學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）（表1，2）。

2.3 大鼠海馬神經(jīng)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)

與NGT組相比，IGR組大鼠飼養(yǎng)15周和20周時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖 1，表 3）。

2.4 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2和Bax免疫組化表達(dá)情況

與NGT組相比，IGR組大鼠飼養(yǎng)15周和20周時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2表達(dá)顯著下降，Bax表達(dá)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖2，3，表4）。

表1 大鼠隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)Table 1 Hidden platform for experiment in rats（x ± s，s，n=10）

表2 大鼠空間搜索實(shí)驗(yàn)Table 2 Space search experiment in rats（x ± s，s，n=10）

圖1 飼養(yǎng)20周后，NGT組與IGR組大鼠海馬組織凋亡細(xì)胞比較Fig 1 Comparison of apoptosis of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

表3 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 3 Apoptosis of rat hippocampal cells in two groups（x ± s，s，n=10）

2.5 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA原位雜交表達(dá)情況

圖2 飼養(yǎng)20周后，NGT組與IGR組大鼠海馬組織Bcl-2表達(dá)比較Fig 2 Expressions of Bcl-2 of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

圖3 飼養(yǎng)20周后，NGT組與IGR組大鼠海馬組織Bax表達(dá)比較Fig 3 Expressions of Bax of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

與NGT組相比，IGR組大鼠飼養(yǎng)15周和20周時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下降，Bax mRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖4，5，表5）。

表4 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)Table 4 Bcl-2/Bax expression in two groups of rats hippocampal nerve cells at the different time points（x ± s，A value，n=10）

圖4 飼養(yǎng)20周后，NGT組與IGR組大鼠海馬組織Bcl-2 mRNA陽(yáng)性表達(dá)Fig 4 Expressions of Bcl-2 mRNA of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

圖5 飼養(yǎng)20周后，NGT組與IGR組大鼠海馬組織Bax mRNA陽(yáng)性表達(dá)Fig 5 Expressions of Bax mRNA of rat hippocampus tissues in NGT group and IGR group after feeding 20 weeks（scale bar=40 μm）

表5 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達(dá)Table 5 Bcl-2 mRNA/Bax mRNA expression in two groups of rats hippocampal nerve cells at the different time points（x ± s，A value，n=10）

2.6 Bcl-2/Bax的表達(dá)水平與認(rèn)知之間的關(guān)系

IGR組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)與Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與Bax陽(yáng)性表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

海馬組織是大腦的重要組成部分。目前已知對(duì)于人和大鼠而言，海馬是學(xué)習(xí)、記憶的重要解剖基礎(chǔ)和神經(jīng)中樞。其中海馬CA1區(qū)神經(jīng)元與空間學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)［6］，故海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞任何形式的損傷都可能會(huì)導(dǎo)致以學(xué)習(xí)和記憶為主的認(rèn)知功能減退。國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道［7］，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致糖尿病或非糖尿病性認(rèn)知障礙的可能原因。

糖調(diào)節(jié)受損（impaired glucose regulation，IGR）包括空腹血糖受損（impaired fasting glucose，IFG）和糖耐量損害（impaired glucose tolerance，IGT）兩種情況，是正常血糖與糖尿病之間的一種代謝異常狀態(tài)，是糖尿病的高危人群。有研究［8］表明，60歲以上老年患者中血糖升高者其杏仁核與海馬體積萎縮，提示在尚未達(dá)到糖尿病水平之前，血糖異常升高可能已經(jīng)對(duì)海馬組織的形態(tài)及功能產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)在糖調(diào)節(jié)受損大鼠造模成功15周后大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力較對(duì)照組明顯降低，提示持續(xù)血糖升高是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要因素。

凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程。Bcl-2基因家族是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的代表性基因家族之一，Bcl-2/Bax作為功能上相對(duì)立的凋亡調(diào)控基因已被深入研究。目前研究［9］表明，Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的重要基因，只表達(dá)在肯定存活的神經(jīng)元上。Bax蛋白在細(xì)胞內(nèi)膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核處有表達(dá)，對(duì)Bcl-2有拮抗作用。當(dāng)Bcl-2相對(duì)量大于Bax時(shí)，Bcl-2同源二聚體增多，促進(jìn)形成Bcl-2-Bax異源二聚體，二者均可抑制細(xì)胞凋亡［10］。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［11-13］表明，高血糖可啟動(dòng)凋亡機(jī)制，促進(jìn)凋亡蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腦細(xì)胞的凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)糖調(diào)節(jié)受損大鼠造模成功15周后海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增加，且與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退明顯相關(guān)，提示血糖增高導(dǎo)致的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降的原因之一。

綜上所述，本研究認(rèn)為糖調(diào)節(jié)受損作為糖尿病前期狀態(tài)已經(jīng)可以引起學(xué)習(xí)記憶能力減退，細(xì)胞凋亡是重要機(jī)制。提示在臨床工作中，不僅要積極預(yù)防糖調(diào)節(jié)受損向糖尿病轉(zhuǎn)化，也要預(yù)防其導(dǎo)致患者學(xué)習(xí)記憶能力減退的不利影響。探討如何抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，可以作為防治糖調(diào)節(jié)受損學(xué)習(xí)記憶能力減退的重要靶點(diǎn)。

［1］Lakshmanan AP，Watanabe K，Thandavarayan RA，et al.Curcumin attenuates hyperglycaemia-mediated AMPK activation and oxidative stress in cerebrum of streptozotocin-induced diabetic rat［J］.Free Radic Res，2011，45:788-795.

［2］Bartoli E，F(xiàn)ra GP，Carnevale Schiance GP，et al.The oral glucose tolerance test（OGTT）revisited［J］.Eur J Intern Med，2011，22:8-12.

［3］王竹，楊月欣，向雪松，等.實(shí)驗(yàn)大鼠血糖正常范圍的估算［J］.衛(wèi)生研究，2010，39:133-137，142.

［4］王俊亞，張東梅.Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)的測(cè)試方法介紹及注意事項(xiàng)［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥生物，2012，28:3289-3290.

［5］郭林芝，李靈敏.大鼠腦組織石蠟切片免疫組化的體會(huì)［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44:311-312.

［6］Reijmer YD，van den Berg E，de Bresser J，et al.Accelerated cognitive decline in patients with type 2 diabetes:MRI correlates and risk factors［J］.Diabetes Metab Res Rev，2011，27:195-202.

［7］馬樓艷，張棟珉，張穎，等.Ghrelin對(duì)糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及其認(rèn)知功能的影響［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31:672-678.

［8］Kerti L，Witte V，Winkler A，et al.Higher glucose levels associated with lower memory and reducedhippocampal microstructure［J］.Neurology，2013，81:1746-1752.

［9］車(chē)?yán)?，王士雷，張?chǎng)?，?線粒體通透性轉(zhuǎn)換在缺血預(yù)處理腦保護(hù)中的作用及機(jī)制［J］.卒中與神經(jīng)疾病，2013，20:67-70，76.

［10］Abes F，Alkan T，Goren B.et al.Neuroprotective effects of postconditioning on lipid peroxidation and apoptesis after focal cerebral isehemia/reperfusion injury in rats［J］.Turkish Neurosur，2010，20:1-8.

［11］Chen J，Guo Y，Cheng W，et al.High glucose induces apoptosis and suppresses proliferation of adult rat neural stem cells followingin vitroischemia［J］.BMC Neurosci，2013，14:24.DOI:10.1186/1471-2202-14-24.

［12］Li X，Zhang M，Tang W.Effects of melatonin on streptozotocin-induced retina neuronal apoptosis in high blood glucose rat［J］.Neurochem Res，2013，38:669-676.

［13］Shah GN，Price TO，Banks WA，et al.Pharmacological inhibition of mitochondrial carbonic anhydrases protects mouse cerebral pericytes from high glucose-induced oxidative stress and apoptosis［J］.J Pharmacol Exp Ther，2013，344:637-645.

The relationship between learning/memory ability and neural cell apoptosis in hippocampal of rats with impaired glucose regulation

ZHAO Lan，DONG Yin-hua，WANG Hong-xin*，LIANG Pei-fen
（Dept.of Neurology，the Fourth Central Hospital in Tianjin，Tianjin 300140，China）

ObjectiveTo identify the relationship between impaired glucose regulation of neuronal apoptosis in hippocampus and the ability of learning/memory in rats.MethodsThe model rats were made by high fat and sugar diet;The morris water maze was used to detect the learning and memory function;The TUNEL method was used to detect neuronal apoptosis in hippocampus.Expression of Bcl-2/Bax and Bcl-2 mRNA/Bax mRNA factor in hippocampus neurons was detected with immunohistochemistry andin situhybridization.ResultsCompared with NGT group，in IGR group the learning and memory ability were meaningfully decreased（P＜0.05）;the number of neuronal apoptosis in hippocampus was increased significantly（P＜0.05）;the expression of Bcl-2 and Bcl-2 mRNA in hippocampus decreased significantly（P＜0.05）;the expression of Bax and Bax mRNA in hippocampus increased significantly（P＜0.05）;The ability of learning and memory was positively correlated with expression of Bcl-2（P＜0.05）and negatively correlated to the expression of Bax（P＜0.05）.ConclusionsThere is a relationship between impaired glucose regulation and the ability of learning and memory in rats，its mechanism may be potentially related to hippocampal neuronal apoptosis.

impaired glucose regulation;learning and memory;neuronal apoptosis;hippocampus

R741.02

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.017

1001-6325（2015）09-1232-05

2015-03-05

2015-05-28

天津市衛(wèi)生局基金（2012KZ015）

*通信作者（corresponding author）:wh1963919@163.com