張尤歷，趙 義，張行行，王國英，龔愛華，倪 鑫，徐 岷*

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科;2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

長鏈非編碼RNA UCA1對(duì)胰腺癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移的影響

張尤歷1，趙 義1，張行行1，王國英1，龔愛華2，倪 鑫1，徐 岷1*

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科;2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

目的 探討尿路上皮癌相關(guān)1（UCA1）在胰腺癌中的表達(dá)及其對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法 用熒光定量PCR檢測(cè)11例胰腺癌組織和配對(duì)的癌旁組織及5種胰腺癌細(xì)胞系中UCA1的表達(dá)，通過RNA干擾技術(shù)降低胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3的UCA1水平，用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察BxPC-3細(xì)胞的侵襲和遷移能力，Western blot檢測(cè)MMP-2和MMP-9的蛋白水平。結(jié)果 胰腺癌組織的UCA1水平高于相應(yīng)的癌旁組織（P＜0.05），UCA1差異性表達(dá)于5種胰腺癌細(xì)胞系;干擾UCA1后，BxPC-3細(xì)胞的MMP-2和MMP-9的蛋白水平均降低（P＜0.01），侵襲能力和遷移能力明顯減弱（P＜0.01）。結(jié)論 UCA1在胰腺癌中高表達(dá)，下調(diào)UCA1通過降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)減弱胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3的體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。

胰腺腫瘤;腫瘤侵襲;腫瘤轉(zhuǎn)移;長鏈非編碼RNA;尿路上皮癌相關(guān)1

胰腺癌是侵襲性極強(qiáng)的腫瘤，預(yù)后非常差［1］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度大于200個(gè)核苷酸的RNA分子，由于缺乏開放的閱讀框，lncRNA并不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后3個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)［2］。近年來，研究表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［3］。H19［4］和 MALAT-1［5］可影響胰腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學(xué)過程。

尿路上皮癌相關(guān)1（urothelial carcinoma-associated 1，UCA1）是在膀胱癌中篩選并克隆出的一種膀胱癌特異性 lncRNA，全長1 439 bp，位于染色體19p13.12［6］。研究發(fā)現(xiàn) UCA1可促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌［7］和黑色素瘤［8］的生長和轉(zhuǎn)移。然而，UCA1 在胰腺癌中的表達(dá)情況及其作用尚不清楚。本研究探討UCA1對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，為臨床研發(fā)新的診斷胰腺癌的試劑盒和針對(duì)胰腺癌的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本和細(xì)胞系:胰腺癌組織和配對(duì)的癌旁組織樣本由上海長海醫(yī)院提供;胰腺癌細(xì)胞系SW1990、耐吉西他濱 SW1990（SW1990/Gem）、PANC-1、Patu8988和BxPC-3由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室凍存。用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone公司）;Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）;Trizol（Invitrogen公司）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒（TaKaRa公司）;siRNA（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）;BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber（BD公司）;MMP-2、MMP-9和β-actin單克隆抗體（Abcam公司）;引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄和real-time PCR

收集對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗3次，按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)其純度及濃度，－80℃保存。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板擴(kuò)增U6和UCA1，U6作為內(nèi)參。Realtime PCR的反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。分析熔解曲線以確定擴(kuò)增產(chǎn)物為單一目的片段，查看基因的擴(kuò)增情況，并導(dǎo)出相應(yīng)的域值循環(huán)Ct值。采用2－ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（RQ 值），計(jì)算公式為 RQ=2－ΔΔCt，ΔCt=Ct目的－Ct內(nèi)參，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)－ ΔCt對(duì)照。

1.3 轉(zhuǎn)染siRNA

轉(zhuǎn)染前1d將BxPC-3接種到6孔板，使細(xì)胞在24 h內(nèi)匯合度達(dá)到30% ～50%，按照LipofectamineTM2000的說明書操作，將 siRNA和 LipofectamineTM2000分別加入250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min后將兩者混合，輕柔混勻，靜置20 min后將500 μL siRNA/LipofectamineTM2000復(fù)合物逐滴加到6孔板，培養(yǎng)箱中孵育48～72 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其他實(shí)驗(yàn)。siRNA序列為:UCA1-siRNA1正義5'-GAGCCGAUCAGACAAACAATT-3'，反 義 5'-UUG UUUGUCUGAUCGGCUCTT-3';UCA1-siRNA2正義5'-GGGCUUGGGACAUUUCACUTT-3'，反義 5'-AGU GAAAUGUCCCAAGCCCTT-3';UCA1-siRNA3正義5'-GGGAAUACUAUUCGUAUGATT-3'，反義 5'-UCA UACGAAUAGUAUUCCCTT-3';陰性對(duì)照正義5'-U UCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義 5'-ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT-3'。

1.4 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

當(dāng)轉(zhuǎn)染了Ctrl siRNA和UCA1 siRNA的BxPC-3細(xì)胞的匯合度達(dá)到80% ～90%時(shí)，用200 μL槍頭劃痕，槍頭要垂直劃過，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致，用PBS輕輕清洗細(xì)胞3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，于0、24及36 h在倒置顯微鏡拍照，觀察劃痕愈合情況。

轉(zhuǎn)染48 h后，消化并離心收集BxPC-3細(xì)胞，用無血清DMEM清洗細(xì)胞3次，然后用無血清DMEM重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，在小室下層加入含10%胎牛血清的DMEM，上層則加入200 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱中孵育48 h后取出小室，用干棉簽輕輕擦去小室上層未穿過Matrigel膠的細(xì)胞，再用PBS濕潤的棉簽擦拭2次，小室浸入4%多聚甲醛室溫固定30～60 min后，將小室侵入0.1%結(jié)晶紫中染色30～60 min，用PBS清洗小室數(shù)次，室溫中風(fēng)干。在200倍的顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blot

轉(zhuǎn)染后48～72 h收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗3次，加入適量RIPA/PMSF裂解液，冰上裂解30 min后，4℃、14 000×g離心15 min，吸取上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度，蛋白樣品調(diào)至等濃度后經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床上封閉2 h，一抗（MMP-2抗體1∶1 000稀釋、MMP-9 抗體 1∶1 000 稀釋、β-actin 抗體1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min;HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000稀釋）37℃溫箱中孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min;ECL化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 UCA1在胰腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示63.6%（7/11）的胰腺癌組織的UCA1水平高于癌旁組織（P＜0.05）（圖1A）;UCA1差異性表達(dá)于5種胰腺癌細(xì)胞系，其中Patu8988表達(dá)相對(duì)最低，而BxPC-3中UCA1的表達(dá)水平相對(duì)最高（圖1B）。

2.2 siRNA下調(diào)UCA1的表達(dá)

3種 siRNA均可下調(diào) UCA1的表達(dá)，其中UCA1-siRNA2的作用更明顯（P＜0.001），故選用UCA1-siRNA2做下游實(shí)驗(yàn)（圖2）。

2.3 干擾UCA1抑制BxPC-3細(xì)胞的遷移

劃痕36 h后，對(duì)照組siRNA組細(xì)胞的劃痕已基本消失，而轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA的細(xì)胞的劃痕仍清晰可見（圖3）。

2.4 干擾UCA1抑制BxPC-3細(xì)胞的侵襲

轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA后，BxPC-3細(xì)胞穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)（9.80±1.92）顯著低于對(duì)照組（36.40±7.50）（P＜0.001）（圖4）。

2.5 干擾UCA1下調(diào)BxPC-3細(xì)胞MMP-2和MMP-9的蛋白水平

UCA1 siRNA組的MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）（圖5）。

圖1 UCA1在胰腺癌組織和5種胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 1 The expression level of UCA1 in pancreatic cancer tissues and 5 pancreatic cancer cell lines（±s，n=3）

圖2 siRNA干擾UCA1的表達(dá)Fig 2 Effect of UCA1-siRNA on the UCA1 level in BxPC-3

圖3 下調(diào)UCA1對(duì)BxPC-3遷移能力的影響Fig 3 Down-regulation of UCA1 influenced the migration of transfected BxPC-3

圖4 下調(diào)UCA1對(duì)BxPC-3侵襲活性的影響Fig 4 Down-regulation of UCA1 influenced the invasion of transfected BxPC-3（×200）

圖5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后BxPC-3的MMP-2和MMP-9的表達(dá)Fig 5 The protein levels of MMP-2 and MMP-9 of transfected BxPC-3 was tested by Western blot

3 討論

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，盡管胰腺癌僅占所有癌癥患者的2.8%，但卻是第4位最常見的致死性腫瘤，5年生存率＜6%［9］。大多數(shù)患者診斷時(shí)已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移是胰腺癌治療的最大難題。因此，探討胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

近年來，非編碼RNA在基因調(diào)控中的作用引起了研究者的注意，其中microRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已得到廣泛的研究并取得一定的成果［10］。lncRNA作為非編碼RNA的新角色，可影響胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞代謝等多種生物學(xué)過程。隨著基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，逐漸有研究表明一些lncRNA如HOTAIR、MALAT-1和H19等在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。UCA1是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種膀胱癌特異性lncRNA，在整個(gè)胚胎發(fā)育階段，UCA1差異性表達(dá)于各種器官，而出生后，除了心臟、脾臟和胎盤組織，大多數(shù)正常組織不表達(dá)UCA1，但在一些腫瘤尤其是膀胱癌中，UCA1的水平又增高，UCA1的這種時(shí)間性和空間性表達(dá)提示其可能作為一種癌胚基因在胚胎發(fā)育和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色［11］。已有研究指出UCA1能增加舌鱗狀細(xì)胞癌［7］和黑色素瘤［8］的轉(zhuǎn)移潛能。然而，UCA1在胰腺癌中的表達(dá)情況及其可能的作用尚不清楚。

本研究旨在探索UCA1在胰腺癌中的表達(dá)水平及其潛在的作用。通過熒光定量PCR檢測(cè)胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞系的UCA1水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCA1高表達(dá)于胰腺癌組織并差異性表達(dá)于胰腺癌細(xì)胞系，鑒于UCA1對(duì)多種腫瘤的惡性行為的影響，本研究采用siRNA下調(diào)BxPC-3細(xì)胞的UCA1表達(dá)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出干擾UCA1的表達(dá)明顯減弱胰腺癌細(xì)胞的體外侵襲和遷移能力。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)血管形成，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用，其中MMP-2和MMP-9可促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移［12］。因此，本研究想探討UCA1是否通過調(diào)節(jié)MMP-2和MMP-9影響胰腺癌的轉(zhuǎn)移過程。Western blot結(jié)果顯示，干擾UCA1后，BxPC-3細(xì)胞的MMP-2和MMP-9的表達(dá)量均降低。結(jié)果提示胰腺癌中高水平的UCA1可能通過上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移。

本研究僅初步探討UCA1在胰腺癌轉(zhuǎn)移中的潛在作用，由于腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制非常復(fù)雜，仍需大量的研究來闡明UCA1是如何調(diào)控胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，這將為胰腺癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)。

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Effect of long non-coding RNA UCA1 on invasion and metastasis of pancreatic cancer cell lines

ZHANG You-li1，ZHAO Yi1，ZHANG Xing-xing1，WANG Guo-ying1，GONG Ai-hua2，NI Xin1，XU Min1*

（1.Dept.of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University;2.Dept.of Cell Biology Medical College of Jiangsu University，Zhenjiang 212000，China）

ObjectiveTo explore the expression of urothelial carcinoma-associated 1（UCA1）in pancreatic cancer cell lines and its influence on the invasion and metastasis of the pancreatic cancer cells.MethodsThe expression of UCA1 in pancreatic cancer tissues and paired adjacent normal tissues（11 cases）and 5 pancreatic cancer cell lines was analyzed by real-time PCR.The level of UCA1 in BxPC-3 was knocked down by small interfering RNA.The ability of invasion and migrationin vitroof transfected BxPC-3 was detected by Transwell invasion assay and wound healing assay.The protein levels of MMP-2 and MMP-9 were measured by Western blot experiment.ResultsThe expression level of UCA1 in pancreatic cancer tissues was higher than that in paired adjacent normal tissues，and UCA1 differentially expressed in 5 pancreatic cancer cell lines.Down-regulation of UCA1 by siRNA suppressed the expression of MMP-2 and MMP-9 in BxPC3，and dramatically impaired the ability of invasion and migration of BxPC-3.ConclusionsUCA1 is over-expressed in pancreatic cancer，and down-regulation of UCA1 attenuates the capacity of invasion and metastasisin vitroof BxPC-3 by decreasing MMP-2 and MMP-9.

pancreatic neoplasm;neoplasm invasion;neoplasm metastasis;long non-coding RNA;urothelial carcinomaassociated 1

2015-02-03

2015-04-24

江蘇省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目（H201434）;鎮(zhèn)江市科技支撐計(jì)劃（SH2014024）*< class="emphasis_bold">通信作者（corresponding author）:

（corresponding author）:peterxu1974@163.com

R576

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.015

1001-6325（2015）09-1223-05