張軍峰，史利利，張 力，李紅波，張建水，祁存芳，劉 勇，徐 曦*

（1.西安醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，陜西西安 710021;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物學(xué)研究所，陜西西安 710061）

HRE介導(dǎo)的NT-3表達(dá)上調(diào)減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷

張軍峰1，史利利1，張 力1，李紅波1，張建水2，祁存芳2，劉 勇2，徐 曦1*

（1.西安醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，陜西西安 710021;2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)生物學(xué)研究所，陜西西安 710061）

目的 在大鼠局灶性腦缺血模型中觀察低氧反應(yīng)元件（HRE）介導(dǎo)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3（NT-3）缺血/低氧調(diào)控表達(dá)及其對(duì)缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用。方法 將重組反轉(zhuǎn)錄病毒（RV-5HRE-NT3及RV-5HRE-EGFP）或0.9%氯化鈉溶液（對(duì)照組）注射入大鼠腦內(nèi)3 d后，用大腦中動(dòng)脈線栓阻塞法（tMCAO）制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型。用免疫組織化學(xué)染色法和Western blot法檢測(cè)NT-3的表達(dá)，用TTC染色法檢測(cè)腦梗死體積，用TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，用Reglodi評(píng)分法檢測(cè)大鼠神經(jīng)功能情況。結(jié)果 大鼠tMCAO 3 d后RV-5HRE-NT3組中NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組和RV-5HRE-EGFP組，且著色較深;tMCAO后第1、3、7和14天，RV-5HRE-NT3組中的NT-3蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組和RV-5HRE-EGFP組（P＜0.05）。在RV-5HRE-NT3組中，tMCAO 3 d大鼠腦梗死體積百分比明顯減?。≒＜0.05），tMCAO 3和7 d后缺血半暗帶凋亡細(xì)胞百分比也明顯減少（P＜0.05）。RV-5HRE-NT3注射可以改善大鼠tMCAO后的神經(jīng)功能障礙。結(jié)論 HRE介導(dǎo)的NT-3低氧反應(yīng)性表達(dá)上調(diào)可以減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷。

低氧誘導(dǎo)基因表達(dá);神經(jīng)保護(hù);缺血性腦卒中;基因治療

*通信作者（corresponding author）:xmux@qq.com

缺血性腦卒中是臨床上常見(jiàn)的嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，具有致死率和致殘率高等特點(diǎn)［1］。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3，NT-3）是一種具有多功能的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，除了維持神經(jīng)元存活、誘導(dǎo)神經(jīng)元分化和促進(jìn)神經(jīng)損傷修復(fù)的神經(jīng)保護(hù)作用外，其還與血管發(fā)生密切相關(guān)，是治療缺血性腦卒中的理想選擇之一［2］。采用基因表達(dá)載體將NT-3導(dǎo)入腦組織或腦血管中，通過(guò)其在局部的表達(dá)可以對(duì)腦組織產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。但是外源基因在腦內(nèi)過(guò)表達(dá)可能會(huì)引起癲癇和腫瘤等不良反應(yīng)，因此，構(gòu)建靶向性和可控性的基因載體對(duì)解決基因治療的安全性非常重要。

在多種組織出現(xiàn)低氧時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）與低氧反應(yīng)元件（hypoxia responsive element，HRE）相互作用，可以誘導(dǎo)一系列低氧相關(guān)基因表達(dá)［3］。腦缺血后局部組織存在的低氧微環(huán)境致HIF-1α表達(dá)上調(diào)［4］，鑒于缺血性腦卒中的此特性，本研究將5個(gè)拷貝的人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來(lái)源的HRE（5HRE）與猴空泡病毒40最小啟動(dòng)子（simian virus 40 minimal promoter，SV40mp）連接組成低氧調(diào)控序列，與NT-3序列融合后構(gòu)建成重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體，在大鼠局灶性腦缺血模型中觀察5HRE對(duì)目的基因NT-3表達(dá)的缺血/低氧靶向性調(diào)控作用，及5HRE-NT3轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:反轉(zhuǎn)錄病毒RV-EGFP、RV-5HRE-EGFP和RV-5HRE-NT3由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、包裝、純化和濃縮（圖1）。SPF級(jí)SD大鼠，雄性，250～300 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（SCXK［陜］2012-003）。

1.1.2 試劑:2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC，Sigma公司）;兔抗人NT-3單克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（Santa Cruz公司）;ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（Pierce公司）;DeadEndTMColorimetric TUNEL System試劑盒（Promega公司）。

1.2 方法

圖1 重組反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Structure of the recombinant retroviral vectors

1.2.1 腦組織注射反轉(zhuǎn)錄病毒:適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組（注射0.9%氯化鈉溶液）、RV-5HRE-EGFP注射組、RV-5HRE-NT3注射組。參照大鼠立體定位圖譜，選擇兩點(diǎn)進(jìn)行注射（圖2A），坐標(biāo):前囟水平，矢狀縫右側(cè)旁開(kāi)2.5 mm，硬腦膜下4 mm和3 mm兩點(diǎn);0.9%氯化鈉溶液或者病毒注射劑量 10 μL，注射速度 1 μL/min。3 d后，用大腦中動(dòng)脈線栓阻塞法（tMCAO）制作局灶性腦缺血模型［5］。

圖2 病毒腦內(nèi)注射部位（A）及注射3 d后EGFP表達(dá)情況（B）Fig 2 Injection sites of the vectors（A）and expression of EGFP three days after injection（B）（×40）

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色和Western blot蛋白印跡法:tMCAO 3 d后，用免疫組織化染色法檢測(cè)腦內(nèi)NT-3的表達(dá)，DAB顯色、蘇木精對(duì)核進(jìn)行復(fù)染、中性樹(shù)膠封片，采集圖像并分析。此外，為檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)大鼠腦內(nèi)細(xì)胞感染的有效性，在腦內(nèi)注射RV-EGFP 3d后，用熒光顯微鏡觀察大鼠腦內(nèi)報(bào)告基因EGFP表達(dá)情況。tMCAO 1、3、7和14 d后，用Western blot蛋白印跡法檢測(cè)腦內(nèi)NT-3的表達(dá);以注射針道為基準(zhǔn)，分別在其吻側(cè)和尾側(cè)2 mm處作冠狀切，從此腦片切取大腦缺血半暗帶組織，RIPA裂解法抽提細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot蛋白印跡，結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參吸光度的比值來(lái)表示。

1.2.4 TTC染色及缺血體積計(jì)算:tMCAO 3 d后，用10%水合氯醛（350mg/kg，腹腔）麻醉大鼠，快速斷頭，分離腦組織，將其置于預(yù)冷的大鼠腦切片模具中切片，放于37℃預(yù)熱的1%TTC溶液中，37℃孵育15 min;采集圖片后用圖像分析軟件Image-Pro Plus測(cè)量每個(gè)腦片缺血梗死面積和雙側(cè)半球的面積，結(jié)合腦切片間距離計(jì)算腦缺血梗死體積。水腫指數(shù)用缺血對(duì)側(cè)半球的體積除以同側(cè)半球的體積來(lái)表示，實(shí)際梗死體積用測(cè)量的梗死體積除以水腫指數(shù)［6］。

1.2.5 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定方法:參照Reglodi等［7］的大腦中動(dòng)脈阻塞大鼠神經(jīng)功能測(cè)試評(píng)分方法，在tMCAO 前1 d，tMCAO 后1、3、5、7、14 和28 d 對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.2.6 TUNEL染色:tMCAO 3和7 d后，用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。按照說(shuō)明書完成標(biāo)記后，用蘇木精將核復(fù)染;采集圖片后用Image-Pro plus圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，每個(gè)樣本取3張尾殼核腦片進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每張腦片在40倍物鏡下取3個(gè)視野對(duì)總細(xì)胞和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果以TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞數(shù)×100%表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組反轉(zhuǎn)錄病毒局部注射后外源基因在大鼠腦內(nèi)的表達(dá)

注射重組反轉(zhuǎn)錄病毒RV-EGFP 3 d后，在注射部位及其附近均有EGFP表達(dá)（圖2B），在對(duì)照組和正常組未見(jiàn)EGFP表達(dá)。

2.2 tMCAO后5HRE上調(diào)缺血的腦組織中NT-3的表達(dá)

tMCAO 3 d后，在RV-5HRE-NT3組，NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯比對(duì)照組和RV-5HRE-EGFP組多，且著色較深（圖3）。在tMCAO 1 d時(shí)，RV-5HRE-NT3組中的NT-3蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組和RV-5HREEGFP組（P＜0.05）（圖4）。在 tMCAO后第 3、7和14天，各組中NT-3的蛋白表達(dá)情況同第1天。

2.3 RV-5HRE-NT3減小大鼠tMCAO后腦梗死體積

tMCAO 3 d后，大鼠腦片TTC染色在正常腦組織被染成紅色，而缺血梗死區(qū)不能著色，仍為白色（圖5A）。與對(duì)照組和 RV-5HRE-EGFP組相比，RV-5HRE-NT3治療組的梗死體積明顯減?。≒＜0.05）（圖5B）。

2.4 RV-5HRE-NT3減輕大鼠tMCAO后神經(jīng)功能損傷

與正常組相比（tMCAO前1 d），tMCAO后Reglodi評(píng)分明顯升高，且一直持續(xù)到tMCAO后第14天;從 tMCAO后第1～14天，RV-5HRE-NT3組的Reglodi評(píng)分明顯低于對(duì)照組和RV-5HRE-EGFP組（P＜0.05）（圖6）。

圖3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)tMCAO后大鼠腦組織中NT-3的表達(dá)Fig 3 Expression of NT-3 after injection in the ischemic rat brain（×400）

圖4 Western blot檢測(cè)tMCAO后大鼠腦組織中NT-3的表達(dá)Fig 4 Increased NT-3 expression after RV-5H-NT3 transduction in the ischemic rat brain（±s，n=3）

圖5 RV-5H-NT3轉(zhuǎn)導(dǎo)減小大鼠tMCAO后腦梗死體積Fig 5 RV-5H-NT3 transduction attenuated infarct volume of rats subjected to tMCAO（±s，n=6）

2.5 RV-5HRE-NT3減少大鼠tMCAO后細(xì)胞凋亡

在大鼠tMCAO后第7天，凋亡細(xì)胞成棕色著色，結(jié)合復(fù)染的細(xì)胞核，發(fā)現(xiàn)在tMCAO后第7天缺血半暗帶有大量細(xì)胞凋亡，但RV-5HRE-NT3組的凋亡細(xì)胞百分比與對(duì)照組和RV-5HRE-EGFP組相比均顯著降低（P＜0.05）（圖7）。

圖6 RV-5H-NT3轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)大鼠tMCAO后神經(jīng)功能恢復(fù)Fig 6 RV-5H-NT3 transduction improved the neurological status of rats subjected to tMCAO（±s，n=12）

3 討論

低氧特異性基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)已被用來(lái)于動(dòng)物模型中，進(jìn)行低氧相關(guān)疾病的治療研究，如腫瘤、缺血性心肌病和腦卒中等［4，8-9］。在此系統(tǒng)中HIF-1α可以通過(guò)與多拷貝的HRE結(jié)合進(jìn)而觸發(fā)治療基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)其表達(dá)。低氧反應(yīng)性調(diào)節(jié)系統(tǒng)的在體研究中，HRE同樣發(fā)揮著調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的重要作用，即在正常組織中靶基因不表達(dá)或者低表達(dá)，而在缺血/低氧組織中高表達(dá)。因此，5HRE可以作為低氧反應(yīng)性表達(dá)調(diào)控的有效元件，在其介導(dǎo)下常氧條件下外源基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性明顯減少，進(jìn)而可以減少或者消除由于外源基因過(guò)表達(dá)所引起的不良反應(yīng)。低氧條件下，HRE還可以反應(yīng)性上調(diào)下游基因的表達(dá)［10］，通過(guò)5HRE 的調(diào)控，tMCAO 1 d后 NT-3蛋白表達(dá)明顯升高，且持續(xù)至2周。進(jìn)一步說(shuō)明5HRE和SV40mp組合是一種有效的調(diào)節(jié)治療基因低氧/缺血反應(yīng)性調(diào)節(jié)的表達(dá)框。

圖7 RV-5H-NT3轉(zhuǎn)導(dǎo)減少tMCAO大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡Fig 7 RV-5H-NT3 transduction decreased apoptosisin the penumbra（×400）（±s，n=6）

反轉(zhuǎn)錄病毒載體將NT-3轉(zhuǎn)導(dǎo)入大鼠腦后，無(wú)論是由新生神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞，作為一種分泌蛋白，NT-3都可以被釋放到胞外，并擴(kuò)散和作用于周圍組織。所以局部表達(dá)的NT-3可以對(duì)與其毗鄰的很大范圍內(nèi)的缺血/低氧腦組織產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，包括減小大鼠腦缺血損傷的梗死體積百分比、明顯減輕大鼠的神經(jīng)功能損傷。

本研究證實(shí)了在大鼠腦內(nèi)5HRE可以缺血/低氧反應(yīng)性上調(diào)NT-3的表達(dá)。缺血/低氧反應(yīng)性高表達(dá)的NT-3可以減小缺血性腦損傷引起的腦梗死體積和細(xì)胞凋亡，同時(shí)tMCAO后神經(jīng)功能損傷明顯減輕。提示HRE介導(dǎo)的低氧反應(yīng)性調(diào)控系統(tǒng)可以為神經(jīng)系統(tǒng)缺血/低氧性紊亂和其他缺血/低氧相關(guān)疾病的基因治療提供有效的治療方法。

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Up-regulated expression of NT-3 attenuates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats

ZHANG Jun-feng1，SHI Li-li1，ZHANG Li1，LI Hong-bo1，ZHANG Jian-shui2，QI Cun-fang2，LIU Yong2，XU Xi1*

（1.Dept.of Anatomy，Xi'an Medical University，Xi'an 710021;2.Institute of Neurobiology，Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061，China）

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effects of neurotrophin-3（NT-3）expression controlled by five copies of the hypoxia-responsive elements after focal cerebral ischemia.MethodsThree groups of rats

RV-5H-NT3，RV-5H-EGFP or saline injection.Three days after gene transfer，the rats underwent 90 min of transient middle cerebral artery occlusion（tMCAO），followed by 1－28 days of reperfusion.Immunohistostaining and western blotting were performed to detect ischemia/hypoxia-regulated expression of NT-3 controlled by HRE.The volume of brain infarction and the apoptosis were analysised by TTC and TUNEL staining.The neurological scoring was determined by neurological behavior tests.ResultsThree days after tMCAO，brain NT-3 expression was significantly increased in the RV-5HNT3-transduced animals compared with the RV-5H-EGFP or saline group（P＜0.05），and brain infarct volume was smaller in the RV-5H-NT3-transduced group than the RV-5H-EGFP or saline group（P＜0.05）.The percentage of TUNEL-positive cells was reduced in RV-5H-NT3-transduced brains compared with the RV-5HEGFP or saline group 3 and 7 days after tMCAO（P＜0.05）.Furthermore，the neurological status of RV-5H-NT3-transduced rats was better than that of RV-5H-EGFP-or saline-transduced animals from 1 day to 4 weeks after tMCAO（P＜0.05）.ConclusionsHRE may modulate NT-3 expression in the ischemic brain tissue and that the up-regulated NT-3 may effectively improve neurological status following tMCAO due to decreased initial damage.

hypoxia-inducible gene expression;neuroprotection;ischemic stroke;gene therapy

R338;R741.02

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.010

1001-6325（2015）09-1199-06

2015-03-27

2015-05-26

國(guó)家自然科學(xué)基金（81301041）;陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃（2013JK0756、14JK1613、14JK1614）;陜西省青年科技新星項(xiàng)目（2015KJXX-43）;西安醫(yī)學(xué)院博士基金（2012DOC02）;陜西省優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)（陜教位［2014］3號(hào)-1001）