周 涯，李永菊，周洪練，任社華

（遵義醫(yī)學院1.醫(yī)學物理學教研室;2.免疫學教研室，貴州遵義 563000）

局部濕熱聯(lián)合微波消融對乳腺癌荷瘤小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞比例和功能的影響

周 涯1*，李永菊2，周洪練1，任社華1

（遵義醫(yī)學院1.醫(yī)學物理學教研室;2.免疫學教研室，貴州遵義 563000）

目的 探討局部濕熱聯(lián)合微波消融對乳腺癌荷瘤小鼠脾細胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）比例和功能的影響。方法 小鼠隨機分為荷瘤組、局部濕熱/微波消融處理組和局部濕熱聯(lián)合微波消融處理組共4組，每組12只。先建立小鼠乳腺癌實驗動物模型，分別進行局部濕熱、微波消融或局部濕熱聯(lián)合微波消融處理。用FACS檢測脾細胞中Tregs的比例變化;real-time PCR檢測Foxp3 mRNA水平;FACS檢測CTLA-4和GITR的表達;ELISA法檢測TGF-β和IL-10的含量;增殖抑制實驗觀察CD4+CD25－T細胞體外增殖。結果 與單一局部濕熱處理組和微波消融處理組相比，Tregs在局部濕熱聯(lián)合微波消融處理組中的比例顯著降低（P＜0.05）。并且，Tregs細胞的Foxp3、CTLA-4和GITR的表達也明顯降低（P＜0.05），同時TGF-β和IL-10的分泌及抑制功能也顯著削弱（P＜0.05）。結論 濕熱聯(lián)合微波消融可以較單一治療方法更有效的抑制腫瘤生長，這與其降低CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的比例和功能密切相關。

乳腺癌;微波消融;局部濕熱;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）是一群特征性表達叉頭蛋白-3（forkhead box P3，F(xiàn)oxp3）的CD4+T細胞亞群，組成性表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）和糖皮質(zhì)激素誘導腫瘤壞死因子受體（glucocor-ticoid-induced TNF receptor，GITR），主要發(fā)揮免疫抑制功能，在機體免疫自穩(wěn)中發(fā)揮了關鍵作用［1］。Tregs在抗感染免疫、自身免疫、腫瘤免疫和移植免疫等中均發(fā)揮了重要作用［2］。在腫瘤免疫逃逸中，Tregs可通過其膜分子CTLA-4和GITR以及分泌的轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）等抑制機體免疫細胞的功能［3］。因此，Tregs也是近年來臨床腫瘤治療的新靶標之一［4］。

近年來，乳腺癌的發(fā)病率逐年增加，嚴重威脅人類的健康。乳腺癌的免疫逃逸是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要原因。當前，熱療已發(fā)展為臨床乳腺癌的重要治療策略之一，然而其免疫學機制仍待研究闡明［5］。在前期研究中建立了熱療治療乳腺癌動物模型的實驗技術平臺［6］，并觀察到局部濕熱聯(lián)合微波消融可有效抑制乳腺癌的體內(nèi)生長，其機制與血清中IFN-γ的增加密切相關［7］。在本研究中擬進一步觀察局部濕熱聯(lián)合微波消融治療乳腺癌中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的比例和功能變化，以期為后續(xù)的臨床相關治療策略的優(yōu)化和推廣應用提供重要的前期實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級 Balb/c小鼠（H-2d，4～6周齡，雌性）由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供［合格證號:SCXK（渝）2007-0001］，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學院中心實驗室SPF級動物室。

1.1.2 細胞系4T1細胞為Balb/c鼠源性乳腺癌細胞系，由貴州遵義醫(yī)學院免疫學教研室凍存。

1.1.3 主要試劑綠色熒光蛋白（FITC）標記或藻紅蛋白（PE）或異位藻藍蛋白（APC）標記的抗小鼠CD4抗體、抗小鼠CD25、抗小鼠CTLA-4和抗小鼠GITR抗體及同型對照抗體（BD公司）;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞MACS分析試劑盒（美天妮公司）;鼠TGF-β和IL-10的ELISA檢測試劑盒（eBioscinece公司）;MTT試劑盒（Tiangen公司）;其他使用的試劑均為分析純級。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌小鼠模型的建立及處理:將4T1細胞培養(yǎng)于含100 mL小牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素及2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640細胞培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，收集對數(shù)增殖期的細胞，Balb/c小鼠乳墊處皮下接種（2×105個細胞/只），當腫瘤大于2 mm×2 mm時，判斷為模型建立成功。荷瘤小鼠分為未處理組（Cont）、局部濕熱處理組（local wet hyperthermia，LWH）、微波消融處理組（microwave ablation，MA）和局部濕熱聯(lián)合微波消融處理組（LWH+MA）共4組，每組12只，具體處理方法同前［7］。

1.2.2 流式細胞技術檢測CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞比例及CTLA-4和GITR的表達:常規(guī)分離荷瘤小鼠脾細胞，PBS洗滌后以2×106細胞/L重懸，取100 μL細胞懸液，分別加入FITC標記的抗鼠CD4抗體和 PE標記的抗鼠 CD25抗體，4℃共孵育30 min，用PBS洗去游離的抗體，重懸后用流式細胞儀檢測CD4+CD25+T細胞比例。根據(jù)報道［4］，為了與活化的CD4+T細胞區(qū)分，在分析比例和分選時設門選取了CD4+T細胞中CD25high群體。

對于Tregs上CTLA-4和GITR的表達分析，荷瘤小鼠脾細胞分別加入APC標記的抗鼠GITR抗體或抗鼠 CTLA-4抗體，CD4+CD25high設門（gating）后，檢測Tregs膜上CTLA-4和GITR的表達，同時加做同型抗體對照。

1.2.3 實時定量PCR分析:常規(guī)用FACS分選荷瘤小鼠Tregs細胞。Trizol法提取組織總RNA，按試劑盒試劑說明書指導操作:吸取10 μg mRNA，加入1 μL DNaseⅠ緩沖液和 1 μL DNaseⅠ，用水補足至10 μL 并充分混勻，37 ℃ 作用 30 min，加入 1 μL EDTA，65℃作用10 min后，95℃作用5 min。取5 μL總RNA 進行cDNA 反轉(zhuǎn)錄:加入2 μL oligo dT、4 μL 反轉(zhuǎn)錄緩沖液、1 μL MML-V 反轉(zhuǎn)錄酶、0.19 μL RNase抑制劑和 7.81 μL DEPC 處理水，42℃ 1 h，85℃ 10 min。反應產(chǎn)物于－20℃保存。Real-time PCR按試劑盒說明書操作，對Foxp3的表達進行定量分析。小鼠內(nèi)參基因GAPDH和Foxp3引物由上海生工公司合成。GAPDH上游引物:5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，下游引物:5'-CA AAGTTGTCATGGATGHACC-3';Foxp3上游引物:5'-ATCTCCTGGATGAGAAAGGCAAGG-5'，下游引物:5'-AGAGCTCTTGTCCATTGAGGCCA3'。反應體系:2 × SYBR（r）Premix Ex TaqTM10 μL，dH2O 8 μL，cDNA 1 μL，PCR 上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，PCR 下游引物（10 μmol/L）0.5 μL。反應步驟:95℃預變性 30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃30 s，45個循環(huán);獲取熒光信號溫度為84℃，以排除引物二聚體的干擾;55℃至95℃，每升高0.2℃采集1次熒光，繪制熔解曲線以確定擴增產(chǎn)物的特異性。所得數(shù)據(jù)采用2－ΔΔct法分析。

1.2.4 增殖抑制實驗:將MACS分選的CD4+CD25－T淋巴細胞以數(shù)量2×105細胞/孔加入96孔板，用2 μg/mL的抗CD3和抗CD28抗體刺激。再按2∶1的靶細胞與效應細胞的比例分別加入各荷瘤組FACS分選的 Tregs（CD4+CD25－T細胞作為靶細胞）。置37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h。每組設3復孔。最后用MTT試劑盒檢測T細胞的增殖，檢測A570值。CD4+CD25－T 細胞增殖抑制率（%）［3］=（對照組A值－試驗組A值）/對照組A值。

1.2.5 IL-10和TGF-β分泌水平的檢測:常規(guī)用FACS分選荷瘤小鼠Tregs細胞。以數(shù)量2×105細胞/孔加入96孔板，用2 μg/mL的抗CD3和抗CD28抗體刺激。同時加入50 IU的IL-2。培養(yǎng)72 h后收集上清，按試劑盒說明操作檢測上清中TGF-β和IL-10的水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 荷瘤小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的比例變化

與對照荷瘤組相比，各處理組中Tregs的比例均有一定程度降低（P＜0.05）;然而，與單獨的濕熱處理組和微波處理組相比，濕熱處理聯(lián)合微波消融處理組中 Tregs的比例變化也顯著降低（P＜0.05）（圖1）。

2.2 荷瘤小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的Foxp3的表達變化

圖1 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的比例Fig 1 The proportion of CD4+CD25+regulatory T cells

與對照未處理組相比，各處理組中Tregs的Foxp3 mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05）;與單獨的濕熱處理組和微波處理組相比，濕熱聯(lián)合微波處理組Tregs中Foxp3的mRNA相對表達水平也明顯減少（P＜0.05）（圖2）。

圖2 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞中Foxp3的相對表達量Fig 2 The relative expression of Foxp3 in CD4+CD25+regulatory T cells（x ± s，n=4）

2.3 荷瘤小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的CTLA-4和GITR表達變化

與對照未處理組相比，各處理組中 Tregs上CTLA-4和GITR的表達水平均明顯降低（P＜0.05）;與單獨的濕熱處理組和微波處理組相比，濕熱聯(lián)合微波處理組中Tregs上CTLA-4和GITR的表達也明顯減少（P＜0.05）（圖3）。

2.4 荷瘤小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞分泌IL-10和TGF-β的變化

與對照相比，各處理組中Tregs分泌的TGF-β和IL-10的水平均明顯減少（P＜0.05）;與前面膜分子表達結果一致，局部濕熱聯(lián)合微波消融組Tregs分泌TGF-β和IL-10的水平也顯著低于單獨的濕熱處理組和微波處理組（P＜0.05）（圖4）。

2.5 荷瘤小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞體外抑制功能的變化

各處理組中Tregs抑制活性均明顯減弱（P＜0.05）;并且濕熱處理聯(lián)合微波處理組中Tregs抑制活性顯著低于單獨的濕熱處理和微波處理組（P＜0.05）（表1）。

3 討論

目前，熱療已發(fā)展成為一種重要的臨床乳腺癌治療策略。由于單一熱療治療腫瘤的效果仍需進一步提高，因此復合熱療方法近年來也得到了快速發(fā)展［5］。然而，熱療治療腫瘤的作用機制特別是免疫學機制仍待研究闡明［8］。已有的研究顯示，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）在乳腺癌免疫逃逸中發(fā)揮了重要作用，并且去除Tregs或抑制其功能可有效增強機體抗腫瘤免疫應答［1，3，8］。本研究結果顯示，單一濕熱處理、微波消融處理或濕熱聯(lián)合微波治療均可有效降低荷瘤小鼠脾細胞中Tregs的比例，并且Tregs細胞的Foxp3表達水平也有明顯降低，提示Tregs的數(shù)量降低是熱療治療乳腺癌的重要免疫學機制。有意思的是，與單一濕熱處理或微波消融處理組相比，濕熱聯(lián)合微波處理組中Tregs的比例變化也非常顯著。同時，還觀察到Tregs的Foxp3表達水平有顯著降低，這提示與單一熱療相比，聯(lián)合熱療可更有效地降低Tregs的數(shù)量和削弱其關鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達。

圖3 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞上GITR和CTLA-4的表達Fig 3 The expression of CTLA-4 and GITR on CD4+CD25+regulatory T cells

圖4 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的IL-10和TGF-β的分泌Fig 4 The secretion of IL-10 and TGF-β of CD4+CD25+regulatory T cells（x ± s，n=4）

表1 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞對CD4+CD25－T細胞體外增殖的抑制率Table 1 The inhibitory ratio of CD4+CD25+regulatory T cells on the proliferation of CD4+CD25－T cells

膜分子CTLA-4和GITR的表達對于Tregs發(fā)揮免疫抑制功能具有重要作用［9-10］。為了探討濕熱聯(lián)合微波處理對Treg抑制功能的影響，檢測了荷瘤小鼠中Tregs上CTLA4和GITR的表達變化，發(fā)現(xiàn)濕熱聯(lián)合微波處理可以較單一的微波消融和濕熱處理方法更顯著地削弱Tregs上CTLA4和GITR的表達。此外，還發(fā)現(xiàn)Tregs分泌抑制性細胞因子TGF-β和IL-10的水平也顯著降低。已有的研究表明，TGF-β和IL-10的分泌對于Tregs的抑制功能也具有重要作用［11-12］。最后，發(fā)現(xiàn)Tregs體外抑制功能也顯著削弱，這與前期發(fā)現(xiàn)濕熱聯(lián)合微波處理后荷瘤小鼠免疫功能增強是一致的［7］。鑒于Foxp3是Tregs抑制功能維持的關鍵轉(zhuǎn)錄因子［13-14］，推測濕熱聯(lián)合微波處理能更有效地削弱Tregs的功能及相關分子表達與Tregs中Foxp3表達降低密切相關。如前所述，在后續(xù)研究中，將進一步探討Tregs功能削弱特別是Foxp3表達降低的分子機制。

總之，通過本研究，發(fā)現(xiàn)局部濕熱聯(lián)合微波治療可以有效降低Tregs的比例并削弱Tregs的抑制功能，這為后續(xù)深入探討聯(lián)合熱療治療乳腺癌腫瘤機制和腫瘤熱療策略的臨床推廣應用及改進提供了重要的前期實驗依據(jù)。

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The effect of wet hyperthermia combined with microwave ablation on the proportion and function of CD4+CD25+regulatory T cell in animal model of mouse mammary carcinoma

ZHOU Ya1*，LI Yong-ju2，ZHOU Hong-lian1，REN She-hua1
（1.Dept.of Medical Physics;2.Dept.of Immunology，Zunyi Medical College，Zunyi 563000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of wet hyperthermia combined with microwave ablation on the proportion and function of CD4+CD25+regulatory T cell in animal model of mouse mammary carcinoma and explore its significance.MethodsAn experimental model of mouse mammary carcinoma was established and then treated with microwave ablation on day 14.Local wet hyperthermia was also performed.The proportion of CD4+CD25+regulatory T cells（Tregs）in splenocytes was analyzed by FACS.The relative expression of Foxp3，as well as the expression of CTLA-4 and GITR，on Tregs was determined by real-time PCR assay and FACS respectively.Moreover，the secretion of TGF-β and IL-10 from Tregs also were detected by ELISA.In addition，the suppressive capacity of Tregs on CD4+CD25－T cell was also examined by MTT assay.ResultsThe proportion of Tregs in wet hyperthermia combined with microwave ablation treated group decreased significantly compared with that in wet hyperthermia or microwave ablation treated alone group（P＜ 0.05）.Moreover，the expression level of Foxp3 on Tregs decreased significantly（P＜ 0.05）.Furthermore，the expression of CTLA4 and GITR，as well as the secretion of TGF-β and IL-10，on Tregs also obviously decreased（P＜ 0.05）.Finally，the suppressive capacity of Tregs on the proliferation of CD4+CD25－T cells were also significantly impaired（P＜ 0.05）.ConclusionsWet hyperthermia combined with microwave ablation os more effective than single wet hyperthermia or microwave ablation as a mono-therapy alone on the function of Tregs，which may be closely related to the enhanced suppression of tumor growth.

breast cancer;microwave ablation;wet hyperthermia;CD4+CD25+regulatory T cells

R392.11

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.008

1001-6325（2015）09-1188-06

2015-02-01

2015-05-07

國家自然科學基金（31370918）;貴州省科技廳聯(lián)合基金（黔科合J字LKZ［2013］24號）;貴州省衛(wèi)生廳項目（D-348）*< class="emphasis_bold">通信作者（corresponding author）:

（corresponding author）:zhouyazmc@163.com