劉曉玲，包韓烏云，趙華路，肖體先，杜鴻琳，王 芳*

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005;2.北京市第五中學(xué)，北京 100007;3.北京市第二十中學(xué)，北京 100085）

ZNF330促進(jìn)紅系分化

劉曉玲1，包韓烏云1，趙華路1，肖體先2，杜鴻琳3，王 芳1*

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物化學(xué)與分子生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005;2.北京市第五中學(xué)，北京 100007;3.北京市第二十中學(xué)，北京 100085）

目的 探索ZNF330對(duì)紅系分化的影響及作用機(jī)制。方法 用hemin誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化，用real-time PCR檢測(cè)ZNF330的表達(dá);ZNF330的RNAi慢病毒顆粒感染CD34+細(xì)胞并向紅系誘導(dǎo)后用real-time PCR檢測(cè)CD235a和γ-globin的表達(dá)。在293T/17細(xì)胞中，用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)ZNF330是否具有轉(zhuǎn)錄激活作用;在293T/17細(xì)胞中，用Co-IP檢測(cè)ZNF330與mRNA降解途徑中ZNF408的相互作用。結(jié)果 在hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞向紅系分化過(guò)程中ZNF330表達(dá)逐漸升高;抑制ZNF330后，CD34+細(xì)胞中紅系分化標(biāo)志CD235a和γ-globin的表達(dá)下降（P＜0.05）;未檢測(cè)到ZNF330的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域;雙向Co-IP證明ZNF330與ZNF408是相互作用蛋白。結(jié)論ZNF330促進(jìn)紅系細(xì)胞分化，一個(gè)可能的機(jī)制是通過(guò)與一個(gè)參與mRNA降解途徑的因子ZNF408的相互作用。

ZNF330;CD34+細(xì)胞;K562細(xì)胞;紅系分化;ZNF408

*通信作者（corresponding author）:wo_wfang@hotmail.com

紅細(xì)胞生成是骨髓多能干細(xì)胞定向分化為各個(gè)鏈系的祖細(xì)胞并進(jìn)一步最終分化為紅細(xì)胞的過(guò)程。最終分化為紅細(xì)胞的數(shù)量與生理和發(fā)育需求相關(guān)，并受到復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)化精密調(diào)控。ZNF330作為人的一種自身抗原，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，其N端的NLS信號(hào)可能對(duì)于ZNF330入核發(fā)揮作用很重要［1］。而其所含的9個(gè)CXXC基序在哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄因子中很常見(jiàn)，屬于鋅指蛋白。已經(jīng)有很多在紅系分化中發(fā)揮重要作用的鋅指蛋白被鑒定出來(lái)，如HZF1（ZNF16）促進(jìn)K562向紅系分化［2-3］。但在本研究中發(fā)現(xiàn)ZNF330并不是作為轉(zhuǎn)錄因子來(lái)發(fā)揮作用的。

mRNA降解途徑是基因表達(dá)調(diào)控中的一個(gè)重要調(diào)控步驟。mRNA的半衰期在細(xì)胞周期或細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)時(shí)會(huì)發(fā)生巨大改變，提示mRNA的降解途徑是一個(gè)可被調(diào)控的過(guò)程［4］。ZNF330的核定位是RNA依賴性的［5］。ZNF408與mRNA降解途徑中的重要蛋白相互作用，本研究證明ZNF330與ZNF408也存在相互作用，因此ZNF330可能是通過(guò)與一個(gè)參與mRNA降解途徑的因子ZNF408的相互作用來(lái)促進(jìn)紅系細(xì)胞分化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料:胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和IMDM培養(yǎng)基（Gibco公司），RNA提取試劑盒Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（TaKaRa公司），雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)試劑盒（Promega公司），CD34分選試劑盒（MiltenyiBiotec公司），HA抗體（醫(yī)科院基礎(chǔ)所細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室），F(xiàn)lag抗體（F-3165，Sigma公司），Actin（sc-1616，Santa Cruz公司）。

1.1.2 細(xì)胞系:人慢性髓系白血病細(xì)胞K562（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心）。293T/17細(xì)胞系（ATCC公司）。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建:ZNF330和ZNF408基因擴(kuò)增自人cDNA文庫(kù)。ZNF330分別克隆入pEGFP-C1、連有Flag標(biāo)簽的pcDNA6/V5-HisB載體以及連有GAL4結(jié)合蛋白的pM載體。pGL3-promoter載體中插入5×GAL4結(jié)合位點(diǎn)。ZNF330的RNAi靶位點(diǎn)為GAGCATCAAGAAGCACTAT，構(gòu)建入 pWPXL載體中。ZNF408克隆入連有HA標(biāo)簽的pcDNA6/V5-HisB載體中。所有的質(zhì)粒均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 CD34+造血干/祖細(xì)胞的分選、感染及培養(yǎng):慢病毒包裝具體方法參照文獻(xiàn)［3］。CD34+細(xì)胞分選及誘導(dǎo)培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［6］培養(yǎng)3或5d。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR:按照說(shuō)明書，用Trizol提取總RNA，并用SuperScript II反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用SYBR? Premix Ex TaqTMkit試劑盒完成 Realtime PCR。以β-actin的mRNA水平做為對(duì)照。所用引物:CD235a上游引物5'-ACAACTTGCCCATCATTT CTCTG-3'，下游引物 5'-ACAACTTGCCCATCATTTC TCTG-3';γ-globin上游引物5'-GCAGCTTGTCACAG TGCAGTTC-3'，下游引物5'-TGGCAAGAAGGTGCTG ACTTC-3';β-actin上游引物 5'-GCAGCTTGTCACA GTGCAGTTC-3'，下游引物 5'-TGGCAAGAAGGTGCT GACTTC-3'。

1.2.4 雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè):轉(zhuǎn)染pGL3-promoter-5×GAL4和 pM-ZNF330入293T/17細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，用1×PBS漂洗1遍，吸去PBS，盡可能吸凈漂洗用PBS。按照雙熒光報(bào)告系統(tǒng)說(shuō)明書檢測(cè)。

1.2.5 免疫共沉淀和Western blot分析:在293T/17細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染入ZNF330-Flag和ZNF408-HA、ZNF330-Flag和含HA的pcDNA6/V5-HisB空載體以及ZNF408-HA和含F(xiàn)lag的pcDNA6/V5-HisB空載體這3種組合。參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行Co-IP實(shí)驗(yàn)及Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 ZNF330促進(jìn)紅系分化

隨著K562向紅系分化時(shí)間的延長(zhǎng)，ZNF330的表達(dá)呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)（圖1A）。通過(guò)綠色熒光蛋白和ZNF330的融合蛋白直觀檢測(cè)抑制效果，可見(jiàn)同時(shí)轉(zhuǎn)染ZNF330-RNAi質(zhì)粒的細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減少（圖1B上），同時(shí)轉(zhuǎn)染了ZNF330-RNAi質(zhì)粒的細(xì)胞中ZNF330蛋白量明顯降低（圖1B下）。在CD34+細(xì)胞中，隨誘導(dǎo)時(shí)間增加，紅系分化的標(biāo)志CD235a和γ-globin的mRNA表達(dá)明顯升高，而在感染了ZNF330 RNAi慢病毒顆粒的CD34+細(xì)胞中，紅系分化的標(biāo)志CD235a和γ-globin的mRNA在誘導(dǎo)第5天時(shí)表達(dá)與對(duì)照細(xì)胞相比明顯降低（P＜0.05）（圖1C）。

圖1 ZNF330促進(jìn)紅系分化Fig 1 ZNF330 promotes erythroid differentiation

2.2 ZNF330不具有轉(zhuǎn)錄激活作用。

報(bào)告基因的熒光素酶活性與ZNF330的表達(dá)量無(wú)關(guān)（圖2）。

圖2 劑量依賴性檢測(cè)ZNF330的相對(duì)熒光素酶活性Fig 2 The relative luciferase activity was detected by a ZNF330 dose-dependent manner（x ± s，n=6）

2.3 ZNF330和ZNF408相互作用

當(dāng)ZNF330作為誘餌蛋白，用抗HA抗體可以檢測(cè)到HA和ZNF408的融合蛋白（圖3A）;當(dāng)ZNF408作為誘餌蛋白，用抗Flag的抗體可以檢測(cè)到Flag和ZNF330的融合蛋白（圖3B）。

圖3 Co-IP檢測(cè)ZNF330和ZNF408的相互作用Fig 3 The interaction between ZNF330 and ZNF408 detected by Co-IP

3 討論

ZNF330是一個(gè)高度保守的自身抗原，雖然較早被發(fā)現(xiàn)，然而其功能卻一直不明確。在本研究中隨著K562向紅系分化時(shí)間的延長(zhǎng)，ZNF330的表達(dá)呈現(xiàn)緩慢上升趨勢(shì)。這可能是由于ZNF330在K562中的基礎(chǔ)表達(dá)比較高，所以在紅系的分化中表達(dá)變化不明顯。當(dāng)在CD34+細(xì)胞向紅系分化的過(guò)程中抑制ZNF330時(shí)，紅系分化受到明顯抑制。說(shuō)明ZNF330促進(jìn)紅系分化。鏈系定向分化是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，每個(gè)鏈系定向都在眾多調(diào)節(jié)因子作用下完成的。這些因子大部分是鋅指蛋白。如C端有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的GATA-1是紅系分化和成熟過(guò)程中的中心轉(zhuǎn)錄因子。然而本實(shí)驗(yàn)證明ZNF330雖然有9個(gè)保守的CXXC結(jié)構(gòu)，卻不能激活報(bào)告基因的表達(dá)。像ZNF330這樣不具有轉(zhuǎn)錄活性的鋅指蛋白也有報(bào)道。如Nsp10，它具有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，卻是通過(guò)與別的蛋白結(jié)合形成復(fù)合物以幫助基因組復(fù)制［7］。

除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在基因表達(dá)調(diào)控中也發(fā)揮著重要的作用。其中mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控著5%～10%的人類基因。順式作用元件和序列特異的RNA結(jié)合蛋白調(diào)控著mRNA降解的速率［8］。mRNA降解調(diào)控著正常基因的表達(dá)［9］。本研究提出一個(gè)新的調(diào)控通路即鋅指蛋白通過(guò)調(diào)控mRNA降解途徑調(diào)控鏈系分化。酵母的Lsm1-7p復(fù)合物定位于細(xì)胞質(zhì)的P小體，后者是mRNA5'→3'降解的激活位點(diǎn)［10］。人的Lsm1-7也定位于細(xì)胞質(zhì)中相當(dāng)于P小體的位置，故可能與mRNA5'→3'降解相關(guān)。Rrp4是外泌小體的RNA結(jié)合亞單位。Upf蛋白對(duì)于mRNA無(wú)義降解很重要［11］。ZNF408和 Lsm2、Rrp4和UPF2（757-1272）相互作用［12］。ZNF330的核定位是 RNA依賴性的，此外紅系分化標(biāo)志CD235a和 γ-globin的表達(dá)降低也可能是抑制ZNF330后促進(jìn)了這些基因的mRNA降解所致，而本實(shí)驗(yàn)也證明ZNF330與ZNF408存在相互作用。故ZNF330可能通過(guò)參與mRNA的降解途徑從而對(duì)紅系分化起調(diào)控作用。

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ZNF330 promotes erythroid differentiation

LIU Xiao-ling1，BAOHAN Wu-yun1，ZHAO Hua-lu1，XIAO Ti-xian2，DU Hong-lin3，WANG Fang1*

（1.Department of Biochemistry and Molecular Biology and State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，
Institute of Basic Medical Sciences，CAMS＆ PUMC，Beijing 100005;2.Beijing No.5 High School，Beijing 100007;3.Beijing No.20 High School，Beijing 100085，China）

ObjectiveTo explore the effects of ZNF330 on erythroid differentiation of K562 cells and underlying mechanism.MethodsRealtime PCR was performed to detect the expression of ZNF330 in K562 cells induced by hemin.After CD34+cells being infected by the recombination lentivirus ZNF330-RNAi，Realtime PCR was applied to detect the expression of CD235a and γ-globin.The luciferase report assay was performed to examine if ZNF330 could act as a trans-acting factor in 293T/17 cells.Co-Immunoprecipitation（Co-IP）was applied in 293T/17 cells to detect the interaction between ZNF330 and ZNF408 which was involved in mRNA degradation.ResultsThe expression of ZNF330 was up-regulated after hemin treatment.The expression of CD235a and γ-globin decreased after inhibition expression of ZNF330 had no effect on report gene.Co-Ip in two ways confirmed the direct binding between ZNF330 and ZNF408.ConclusionsZNF330 can promote erythroid differentiation，and a possible mechanism is that ZNF330 inhibits the function of ZNF408，a factor that is involved in mRNA degradation，through the interaction between the two proteins.

ZNF330;CD34+cells;K562 cells;erythroid differentiation;ZNF408

R34

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.004

1001-6325（2015）09-1167-04

2015-03-04

2015-04-22

國(guó)家自然科學(xué)基金（30871249）