薛妍君,張 麗,馮 莉,姜 麗,郁志芳，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇南京 210095;2.蘇州市農(nóng)科院,江蘇蘇州 215155)

薺菜芳香成分的固相微萃取條件優(yōu)化與分析

薛妍君1,張 麗2,馮 莉1,姜 麗1,郁志芳1，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué),江蘇南京 210095;2.蘇州市農(nóng)科院,江蘇蘇州 215155)

采用固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析薺菜香氣成分,并通過(guò)單因素對(duì)比實(shí)驗(yàn)優(yōu)化萃取條件。結(jié)果表明:選用50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度50℃、時(shí)間40min,解析溫度250℃、時(shí)間3min萃取效果最佳;實(shí)驗(yàn)共鑒定有效香氣成分64種,以醇類、醛類、烴類及含硫雜氧化合物為主。薺菜的特征香氣成分主要有二甲基二硫、正己醛、葉醇、青葉醛、二甲三砜、2,6-二甲基環(huán)己醇、β-紫羅蘭酮等。

薺菜,香氣,固相微萃取(SPME),氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)

香氣是衡量果蔬品質(zhì)的重要指標(biāo),固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)技術(shù)作為一種新的樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)物的分析方法,可與氣相色譜(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用,因此,自20世紀(jì)90年代出現(xiàn)以來(lái)受到廣泛關(guān)注并大量應(yīng)用于各類食品、環(huán)境及生物樣品的檢測(cè)中[1-2]。目前,已通過(guò)SPME技術(shù)鑒別出香氣成分的蔬果主要有桃子[3]、草莓[4]、櫻桃[5]、哈密瓜[6]、龍眼[7]、冬瓜[8]、洋蔥[9]、南瓜[10]等。

SPME萃取過(guò)程受萃取纖維涂層種類、萃取溫度、平衡時(shí)間、解析溫度及時(shí)間、無(wú)機(jī)鹽添加量等很多因素影響,萃取參數(shù)不同,結(jié)果存在很大差異[11]。近年來(lái),很多文獻(xiàn)針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)材料對(duì)SPME操作參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化介紹,但SPME分析薺菜中香氣物質(zhì)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

薺菜為十字花科薺菜屬,一、二年生草本植物,作為食物常以嫩莖、葉供食用,氣味清香甘甜。由于富含谷氨酸等多種氨基酸,味道鮮美至極,被譽(yù)為“野菜之上品”。就香氣而言,薺菜多呈現(xiàn)馥郁的草葉清香和蔬果香氣,郭華等通過(guò)同時(shí)蒸餾萃取方法提取薺菜揮發(fā)油并確定其主要呈香物質(zhì)為葉醇、乙酸葉醇酯及含硫化合物等[12],這與劉宇等通過(guò)水蒸氣蒸餾法獲得的薺菜揮發(fā)油成分略有差異。后者發(fā)現(xiàn),薺菜揮發(fā)油中長(zhǎng)鏈烷烴和有機(jī)酸類化合物含量較高,萜類及酯類化合物含量較低[13]。本文擬采用SPME與GC-MS聯(lián)用分析薺菜香氣成分,并通過(guò)萃取頭的選擇、萃取溫度及時(shí)間、解析溫度及時(shí)間等單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),建立SPME萃取薺菜香氣成分的最佳體系并明確薺菜芳香成分的組成和特征。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生薺菜2012年11月采自南京郊外,成熟度一致、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害,經(jīng)分級(jí)→清洗→除雜→去黃葉→剪除根部后瀝干水分備用。

Trace GC-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo公司;Tri-Plus自動(dòng)進(jìn)樣器 美國(guó)Thermo公司;100μm PDMS、85μm PA、50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭 美國(guó)Supelco公司;15mL萃取瓶 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原材料處理方法 選取大小相同、成熟度一致的薺菜500g,切成1cm長(zhǎng)的小段,隨機(jī)取樣于液氮中研磨成細(xì)粉狀[14],凍藏備用。取樣重復(fù)三次。

1.2.2 SPME技術(shù)參數(shù)優(yōu)化設(shè)計(jì) 以萃取頭種類、萃取溫度、萃取時(shí)間、解析溫度及時(shí)間為單因素設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。萃取頭選用100μm PDMS、85μm PA、50/30μm DVB/CAR/PDMS;萃取溫度控制在30～70℃之間,設(shè)計(jì)30、40、50、60、70℃五個(gè)水平;萃取時(shí)間以20、30、40、50、60min為時(shí)間梯度。

解析溫度及時(shí)間對(duì)比實(shí)驗(yàn):設(shè)計(jì)230～270℃五個(gè)溫度水平和1～5min五個(gè)時(shí)間水平,分別探究解析溫度和時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響。

1.2.3 SPME操作方法 準(zhǔn)確稱取研磨好的薺菜2.0g于15mL萃取瓶中,用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封后置于水浴鍋中平衡20min,將固相微萃取頭在氣相色譜儀進(jìn)樣口老化,100μm PDMS老化溫度250℃、時(shí)間0.5h;85μm PA 280℃老化1h;50/30μm DVB/CAR/PDMS老化溫度270℃、時(shí)間1h。萃取吸附結(jié)束后將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口解析脫附。

1.2.4 GC-MS分析條件 GC條件:HP-5MS(30×0.25×0.25)色譜柱,反復(fù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)升溫程序?yàn)槌鯗?5℃,保留2min,以5℃/min的速度上升到80℃,保持1min;再以8℃/min上升至180℃,保留1min;最后以10℃/min上升至250℃,保留2min;進(jìn)樣口溫度250℃,載氣為He氣,柱流量1mL/min,不分流進(jìn)樣。

MS條件:離子源溫度200℃,電離方式EI,檢測(cè)溫度240℃,電子能70ev,燈絲電流150μA,掃描范圍33～540。

1.2.5 圖譜解析 通過(guò)對(duì)總離子色譜圖峰的分析,經(jīng)計(jì)算機(jī)與NIST Library和Wiley Library質(zhì)譜庫(kù)匹配,挑選出匹配度和反匹配度大于800(最大值1000)的信號(hào)峰,根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量、化學(xué)式及分子結(jié)構(gòu)確定峰物質(zhì)名稱。按峰面積歸一化法計(jì)算百分含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Excel 2007、SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取參數(shù)優(yōu)化

2.1.1 萃取頭的選擇 萃取頭極性和厚度是固相微萃取技術(shù)的核心,對(duì)目標(biāo)物萃取效果有直接影響,不同極性萃取頭針對(duì)的目標(biāo)物極性不同。本實(shí)驗(yàn)選用的三種不同類型萃取頭,PA主要吸附極性半揮發(fā)性物質(zhì),PDMS吸附非極性揮發(fā)性物質(zhì),DVB/CAR/PDMS則對(duì)揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質(zhì)都有較好的吸附效果[15]。三種萃取頭對(duì)新鮮薺菜風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子色譜圖如圖1所示。

由圖1可知,DVB/CAR/PDMS萃取頭對(duì)薺菜風(fēng)味物質(zhì)分離效果最好,捕集香氣組分?jǐn)?shù)最多,為61種,且涵蓋了其它兩種萃取頭所檢測(cè)到的大部分化合物;PDMS萃取頭次之,分離香氣組分23種,多為長(zhǎng)鏈烷烴,對(duì)醇、醛等極性化合物分離效果不好;PA萃取頭萃取效果最差,僅分離出19種香氣成分,以脂肪酸等極性化合物為主,故而薺菜香氣捕集時(shí)宜選用DVB/CAR/PDMS萃取頭。

2.1.2 萃取溫度的優(yōu)化 萃取溫度對(duì)香氣物質(zhì)的分離效果具有雙重性。低萃取溫度下香氣物質(zhì)揮發(fā)速度慢,達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡的時(shí)間長(zhǎng),且低沸點(diǎn)化合物比重增加;反之溫度升高,萃取頭吸附能力降低,萃取效率減小。另外,高溫使部分香氣組分發(fā)生異構(gòu)化或裂解,影響分析結(jié)果的真實(shí)性[16-17]。實(shí)驗(yàn)設(shè)30～70℃五個(gè)溫度水平,以歸一法計(jì)算得到的總峰面積及總峰面積與峰數(shù)的比值為優(yōu)化依據(jù)[18],經(jīng)GC-MS分析,所得結(jié)果見(jiàn)圖2。

隨著萃取溫度的升高,總峰面積和總峰面積/峰數(shù)值呈現(xiàn)上升趨勢(shì),其中30℃和40℃條件下,上升趨勢(shì)緩慢,50℃出現(xiàn)吸附高峰,總峰面積和總峰面積/峰數(shù)值達(dá)到最大,且升高趨勢(shì)極顯著(p<0.01)。繼續(xù)升高溫度,二者數(shù)值均有不同程度降低,60℃降低趨勢(shì)極顯著(p<0.01),70℃顯著(p<0.05)。高溫導(dǎo)致峰面積下降的原因可能是分析物在萃取涂層與基質(zhì)中的分配系數(shù)降低,影響了SPME的靈敏度。另外,高溫條件下,低沸點(diǎn)化合物流失嚴(yán)重,并在與高沸點(diǎn)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)吸附中處于弱勢(shì)地位,使得部分低沸點(diǎn)成分不能被吸附或吸附量減少[19]。綜合以上結(jié)果,最佳萃取溫度設(shè)定為50℃。

2.1.3 萃取時(shí)間的選擇 萃取時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響如圖3所示。40min前隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng),總峰面積及其與峰數(shù)的比值均增加,說(shuō)明香氣物質(zhì)的吸附量不斷增大,20～40min內(nèi),總峰面積由3.2×109增加到4.1×109,變化極顯著(p<0.01),峰面積/峰數(shù)值變化顯著(p<0.05),40min時(shí)二者達(dá)到最大。50～60min,峰面積稍有降低,但降低趨勢(shì)不明顯(p>0.05),峰面積/峰數(shù)值趨于平衡,說(shuō)明萃取頭在40min即處于吸附飽和狀態(tài),繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)改善吸附效果,這可能與待分析物的分配系數(shù)、樣品基質(zhì)及體積、萃取頭涂層的物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)[20],因此,選擇40min為最佳萃取時(shí)間。

圖1 不同萃取頭分離效果比較Fig.1 Total ion chromatogram comparison of volatile flavor compounds extracted by PA(a)、 PDMS(b)and DVB/CAR/PDMS(c)coated fibers

圖2 萃取溫度對(duì)總峰面積(a) 和總峰面積與峰數(shù)比值(b)的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on total peak area(a) and total peak area-to-peak number ratio(S/N)(b)

相對(duì)于萃取溫度,時(shí)間選擇對(duì)香氣物質(zhì)總峰面積的影響要小得多。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)總峰面積(a) 和總峰面積與峰數(shù)比值(b)的影響Fig.3 Effect of extraction time on total peak area(a) and total peak area-to-peak number ratio(S/N)(b)

2.1.4 解析溫度和時(shí)間對(duì)萃取結(jié)果的影響 解析作為固相微萃取操作的關(guān)鍵步驟,其溫度和時(shí)間對(duì)結(jié)果有重要影響。解析溫度過(guò)高,物質(zhì)脫附速度快,解析時(shí)間短,但高溫會(huì)縮短萃取纖維的使用壽命,同時(shí)造成一些香氣物質(zhì)發(fā)生氧化、裂解或異構(gòu)化反應(yīng),影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;解析時(shí)間短易造成解析不完全,污染后續(xù)樣品分析,而長(zhǎng)時(shí)間解析則會(huì)導(dǎo)致峰形變寬,損害分離效果[21]。實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)230～270℃五個(gè)溫度水平和1～5min五個(gè)時(shí)間水平,分別探究解析溫度和時(shí)間對(duì)總峰面積的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4?？偡迕娣e隨解析溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加,當(dāng)溫度達(dá)到250℃,時(shí)間為3min時(shí),峰面積值基本穩(wěn)定,繼續(xù)升高溫度或延長(zhǎng)時(shí)間峰面積值無(wú)明顯變化(p>0.05),因此確定最佳解析條件為250℃,3min。

表1 薺菜香氣成分的GC-MS分析結(jié)果Table 1 Volatile composition of Capsella bursa-pastoris L

圖4 解析溫度(a)和解析時(shí)間(b)對(duì)總峰面積的影響Fig.4 Effect of desorption temperature(a) and time(b)on total peak area

2.2 香氣成分分析

在最優(yōu)萃取條件下對(duì)薺菜進(jìn)行SPME萃取操作,經(jīng)GC-MS檢測(cè)并與NIST Library和Wiley Library質(zhì)譜庫(kù)匹配、篩選,最終確定薺菜中揮發(fā)性香氣成分,結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知,實(shí)驗(yàn)共檢出薺菜有效香氣成分64種,占出峰化合物總數(shù)的92.9%,峰面積和為總峰面積的91.3%,其中醛類物質(zhì)種類最豐富,共檢出18種;其次為醇類物質(zhì)12種;碳?xì)浠衔镒鳛樗j菜香氣成分的重要組成部分,檢出11種;另酯類信號(hào)峰6種,酸類3種,酮類2種。此外,含硫化合物,雜氧化合物(統(tǒng)稱其它化合物)對(duì)薺菜香氣組分也有較大貢獻(xiàn),共分離出12種,占種類總數(shù)的18.75%。劉宇等利用水蒸氣蒸餾法提取薺菜揮發(fā)油,經(jīng)GC-MS分析,共捕集45種化合物,占揮發(fā)油總量的70%[13];郭華等應(yīng)用同時(shí)蒸餾-萃取法分析薺菜揮發(fā)性成分,只分離得到化合物組分17種[12]。本研究結(jié)果表明,SPME不僅能吸附薺菜中較多的揮發(fā)性物質(zhì)成分,而且可提高芳香物質(zhì)的檢出率,因而是一種更有效的檢測(cè)方法。

就含量而言,醇類物質(zhì)和醛類物質(zhì)的相對(duì)含量最高,為薺菜的主要香氣成分,分別占總含量的26.65%和27.03%;其次是含硫及雜氧化合物,相對(duì)含量21%;碳?xì)浠衔锏南鄬?duì)含量也較高,為7.98%,分別是酯類、酸類、酮類物質(zhì)的2.46、2.17、4.67倍。

續(xù)表

色譜圖中,各香氣組分出峰時(shí)間集中在34min前,尤其以10～25min內(nèi)出峰數(shù)量最多,化合物相對(duì)含量最高,主要出峰物多為醇類、醛類、酯類等低沸點(diǎn)化合物,其中含量較高的組分有正己醛、2-甲基-4-戊烯酸、葉醇、青葉醛、反式-2-己烯-1-醇、順-4-庚烯醛、苯甲醛等,相對(duì)含量分別為5.28%、2.17%、6.84%、3.89%、4.91%、1.99%和5.64%,這些多物質(zhì)大都呈現(xiàn)草葉清香和蔬果香,部分物質(zhì)有鮮果、油脂香氣。萃取后期,烷烴類、雜氧化合物等高沸點(diǎn)物質(zhì)居多,大部分物質(zhì)含量較低,但有些化合物如2-正戊基呋喃、桉葉油素、2-甲氧基-3-仲丁基吡嗪等香氣強(qiáng)度高且香氣閾值低,因此對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)作用不可忽視[22]。

值得注意的是,薺菜中含硫化合物含量相當(dāng)豐富,二甲基二硫、二甲三砜、二甲基四硫等硫化物含量高達(dá)14.6%,這與郭華等人的研究結(jié)果一致[12]。

3 結(jié)論

SPME萃取薺菜香氣成分的最優(yōu)萃取參數(shù)為:取2g樣品于15mL萃取瓶中,選用50/30μmDVB/CAR/PDMS纖維萃取頭,50℃平衡20min,萃取40min,解析溫度250℃,解析時(shí)間3min。

優(yōu)化條件下共分離出有效薺菜香氣成分64種,占化合物總數(shù)的92.9%,峰面積和占到總峰面積的91.3%,種類從多到少分別為醛類18種、醇類12種、碳?xì)浠衔?1種、酯類6種、酸類3種、酮類2種、其它化合物12種,相對(duì)含量分別為27.03%、26.65%、7.98%、3.25%、3.68%、1.71%和21%。

薺菜香氣組分主要由醛類、醇類、酯類及含硫化合物等組成,特征化合物包括二甲基二硫、正己醛、葉醇、青葉醛、二甲三砜、2,6-二甲基環(huán)己醇、檸檬醛、β-紫羅蘭酮等,這些物質(zhì)共同作用形成了薺菜特有的香氣特征。

[1]Risticevic S,Niri V H,Pawliszyn J,etal. Recent developments in solid-phase microextraction[J].Analytical Bioanalytical Chemistry,2009,393:781-795.

[2]Cludia N,Manuel A C,Jorge S,etal. Study of the volatile components of a candied plum and estimation of their contribution to the aroma[J].Food Chemistry,2008,111:897-905.

[3]魏好程,王貴禧,梁麗松,等.HS-SPME在桃果實(shí)揮發(fā)性芳香物質(zhì)分析中應(yīng)用研究[J].食品科學(xué),2007,28(7):347-351.

[4]隋靜,姜遠(yuǎn)茂,彭福田,等.草莓果實(shí)發(fā)育過(guò)程中芳香物質(zhì)含量和醇?；D(zhuǎn)移酶活性的變化[J].園藝學(xué)報(bào),2007,34(6):1411-1417.

[5]張序,姜遠(yuǎn)茂,彭福田,等.‘紅燈’甜櫻桃果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中香氣成分的組成及其變化[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,40(6):1222-1228.

[6]馬永昆,周珊,陳計(jì)巒,等.用SPME方法分析不同成熟度哈密瓜香氣的研究[J].食品科學(xué),2004,25(7):136-139.

[7]張義,高蓓,徐玉娟,等.頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法分析龍眼中的揮發(fā)性化合物[J].食品科學(xué),2010,31(16):156-160.

[8]楊敏.冬瓜揮發(fā)性成分的固相微萃取-氣質(zhì)連用分析[J].食品工業(yè)技,2010,31(1):134-137.

[9]孫雪君,徐懷德,米林峰.鮮洋蔥和干洋蔥揮發(fā)性化學(xué)成分比較[J].食品科學(xué),2012,33(22):290-293.

[10]李昌勤,盧引,李新錚,等.HS-SPME-GC-MS分析甜面大南瓜花揮發(fā)性成分[J].食品工業(yè)科技,2012,33(16):151-156.

[11]Yang X G,Peppard T. Solid phase microextraction for flavor analysis[J].Agricultural and Food Chemistry,1994,42:1925-1930.

[12]郭華,侯冬巖,回瑞華,等.薺菜揮發(fā)性化學(xué)成分的分析[J].食品科學(xué),2008,29(1):254-256.

[13]劉宇,李艷輝,寧偉,等.薺菜揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2009,20(5):1050-1051.

[14]鄧曉軍,杜家緯.采用多次頂空固相微萃取分析擬南芥綠葉揮發(fā)性物質(zhì)[J].生態(tài)學(xué)雜志,2005,24(8):970-974.

[15]劉曉慧,張麗霞,王日為,等.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析黃茶香氣成分[J].食品科學(xué),2010,31(16):239-243.

[16]Posen H,Zupanic K L.Solid-phase microextraction[J]. Trends in Analytical Chemistry,1999,18:272-282.

[17]翁麗萍,王宏海,盧春霞,等.SPME-GC-MS法鑒定養(yǎng)殖大黃魚(yú)主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的條件優(yōu)化[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2012,12(9):209-214.

[18]孔維婷,劉建軍,司輝清,等.固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析信陽(yáng)毛尖香氣成分[J].食品科學(xué),2012,33(12):185-189.

[19]唐進(jìn)根,凌娜,楊曉軍.固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定楊樹(shù)葉片的揮發(fā)性物質(zhì)[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2010,39(2):151-152.

[20]余澤紅,賀小賢,丁勇,等.固相微萃取在食品揮發(fā)性組分測(cè)定方面研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2010,7:44-45.

[21]華永兵,宋煥祿.頂空固相微萃取的分段操作[J].食品科學(xué),2005,26(11):197-199.

[22]Buttery R G,Teranishi R,Ling L C,etal. Quantitative and sensory studies on tomato paste volatiles[J]. Agricultural and Food Chemistry,1990,38(1):336-340.

Optimization and analysis of volatile components ofCapsellabursa-pastorisLby SPME-GC-MS

XUE Yan-jun1,ZHANG Li2,FENG Li1,JIANG Li1,YU Zhi-fang1,*

(1.Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;(2.Suzhou Academy of Agricultural Sciences,Suzhou 215155,China)

SPME-GC-MS was used to analysis volatile components ofCapsellabursa-pastorisand the extraction conditions were investigated. Experimental results showed that the optimal SPME extraction time and temperature were 40min and 50℃,while the desorption time and temperature were 3min and 250℃ by using DVB/CAR/PDMS fiber. A total of 64 volatile components were identified mainly of which were aldehydes,alcohols,hydrocarbons and other compounds including sulfide and heterocycle. The characteristic volatile components ofCapsellabursa-pastoriswere disulfide,dimethyl;Hexanal;3-Hexen-1-ol;2-Hexenal,(E)-;Dimethyl trisulfide;Cyclohexanol,2,6-dimethyl-;3-Buten-2-one,4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-and so on.

Capsellabursa-pastorisL;volatile components;SPME;GC-MS

2014-03-10

薛妍君(1987-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬采后生物學(xué)。

*通訊作者:郁志芳(1960-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金( CX(13)5076)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)01-0328-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.061