高超，張山，何永志，黃健忠，董志揚(yáng)

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改造大腸桿菌合成海藻糖途徑以高效合成海藻糖

高超1，張山2，何永志2，黃健忠1，董志揚(yáng)2

1 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心，福建福州 350108 2 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

高超, 張山, 何永志, 等. 改造大腸桿菌合成海藻糖途徑以高效合成海藻糖. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(12): 1784?1788.Gao C, Zhang S, He YZ, et al. Construction of a recombinant Escherichia coli for high trehalose production. Chin J Biotech, 2015, 31(12): 1784?1788.

海藻糖是相容性溶質(zhì)的一種，因其具有多種生物學(xué)功能，在食品、化妝品、藥品以及器官移植等方面均有很廣泛應(yīng)用。然而近幾年生產(chǎn)海藻糖主要集中在使用酶催化的方法，雖然這種方法的轉(zhuǎn)化效率高，但是卻存在著副產(chǎn)物的問題，難以得到高純度的海藻糖產(chǎn)品，嚴(yán)重制約了海藻糖的應(yīng)用。本文通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌中構(gòu)建了海藻糖高效合成新途徑，通過全細(xì)胞催化合成海藻糖。利用PCR技術(shù)在哈氏噬纖維菌中克隆獲得海藻糖雙功能合成酶基因 ()，采用pTac-HisA高效表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)海藻糖雙功能合成酶基因 () 高效表達(dá)，利用高效表達(dá)菌株進(jìn)行全細(xì)胞催化，將葡萄糖高效轉(zhuǎn)化為海藻糖。結(jié)果表明海藻糖合成酶基因 () 在中成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)，該酶能夠在胞內(nèi)將葡萄糖高效轉(zhuǎn)化為海藻糖，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，實(shí)現(xiàn)海藻糖的高效率合成，海藻糖的產(chǎn)量提高到1.2 g/L，相對(duì)轉(zhuǎn)化率為21%。當(dāng)將此高產(chǎn)菌株在發(fā)酵罐中進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，海藻糖的產(chǎn)量達(dá)到13.3 g/L，葡萄糖的相對(duì)轉(zhuǎn)化率達(dá)到48.6%。采用海藻糖合成酶基因高效表達(dá)并且應(yīng)用于海藻糖全細(xì)胞合成催化在國內(nèi)外尚屬首次報(bào)道，海藻糖的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)率都已達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道最高水平，本研究為開拓海藻糖生產(chǎn)新技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

海藻糖，雙功能酶，海藻糖合成酶，全細(xì)胞催化，大腸桿菌，條件優(yōu)化

海藻糖是一種非還原型二糖，在自然界中分布非常廣泛，比如植物、真菌、細(xì)菌等[1]。作為一種生物活性物質(zhì)，海藻糖具有很強(qiáng)的保水性以及對(duì)生物大分子如蛋白、核酸和細(xì)胞膜等的保護(hù)作用[2]。正是由于其上述特性，使得海藻糖具有很好的商業(yè)前景[2-3]。

海藻糖生產(chǎn)的目的是希望獲得高純度的產(chǎn)品，目前生產(chǎn)海藻糖的方法主要包括3個(gè)：一是從生物細(xì)胞中直接提取。釀酒酵母作為傳統(tǒng)的生產(chǎn)海藻糖的菌株，具有在特定的生理?xiàng)l件下海藻糖的含量能達(dá)到細(xì)胞干重的10%–15%[4]的優(yōu)勢(shì)，但是這種方法的效率偏低，如安寧[5]將酵母誘變后通過一系列的優(yōu)化，最終海藻糖的產(chǎn)量達(dá)到了5.4 g/L。二是采用微生物發(fā)酵提取相關(guān)的海藻糖合成酶，使用酶催化法合成海藻糖，如黃英等[6]在中克隆表達(dá)了玫瑰鏈霉菌海藻糖合成酶基因，使用這種海藻糖合成酶可以實(shí)現(xiàn)85%的轉(zhuǎn)化率，但是產(chǎn)物中仍有5%的副產(chǎn)物葡萄糖，導(dǎo)致產(chǎn)品不純，此外這種方法的缺點(diǎn)還包括酶容易失活。三是采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，這種方法由于微生物生長(zhǎng)旺、繁殖快，易于培養(yǎng)，具有先天的優(yōu)越性，結(jié)合全細(xì)胞催化的方法，可以有效降低雜質(zhì)的含量，同時(shí)利用微生物細(xì)胞的代謝可以幾乎完全去除底物，有利于提高海藻糖的純度，因此是一個(gè)潛在的可以獲得高純度海藻糖的方法。

目前構(gòu)建工程菌株合成海藻糖，主要是利用OtsBA途徑[7-8]。研究表明，酶之間的物理距離影響著通路的活力，Seo等[9]通過人工方法將OtsA和OtsB融合在一起，發(fā)現(xiàn)海藻糖合成酶的催化活力提高了3.5–4倍。實(shí)際上，Avonce等[10]發(fā)現(xiàn)哈氏嗜纖維菌中存在著天然狀態(tài)下用于合成海藻糖的雙功能酶TPSP。本實(shí)驗(yàn)首次將雙功能酶TPSP在大腸桿菌中進(jìn)行過表達(dá)，使用全細(xì)胞催化的方法，對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得用于海藻糖合成的高產(chǎn)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌種有DH5α和BW25113，前者購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，后者為實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株。表達(dá)質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室保藏的pTac-HisA，為IPTG誘導(dǎo)。

1.1.2 酶和試劑

高保真DNA擴(kuò)增酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。限制性內(nèi)切酶和堿性磷酸酶購自NEB公司。T4 DNA連接酶購自Themo公司。DNA純化試劑盒、DNA回收試劑盒以及質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技(北京) 有限公司。井岡霉素購自北京華邁科生物科技有限公司。氨芐青霉素和誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 購自Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為國藥試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)化液和抗生素濃度

搖瓶實(shí)驗(yàn)；菌體活化、培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)使用LB培養(yǎng)基，發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[11]，所有轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)均在加有底物葡萄糖的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) 中進(jìn)行，且培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中添加終濃度為100 ng/mL的氨芐青霉素，轉(zhuǎn)化時(shí)還需要添加1 mmol/L海藻糖酶抑制劑井岡霉素。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中ATCC 33406的全基因組序列(gb| CP 000383.1)，設(shè)計(jì)合成tpsp的PCR引物。序列如下：

F1: 5?-ACAGGAAACAGCTAGCATGAATGACG AAAAAAGATT-3?；

F2: 5?-GCTGCAGCTCGAGTTATAAAAACGTAT TCAGAATG-3?。

1.2.2表達(dá)載體的構(gòu)建及tpsp基因的誘導(dǎo)表達(dá)

轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行，質(zhì)粒的提取、酶切與 DNA 片段的回收和連接參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行；誘導(dǎo)表達(dá)參考分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)[13]。使用的基因組為模板構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，使用引物F1和F2擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物和pTac-HisA載體均使用Ⅰ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，膠回收tpsp片段和載體部分片段，經(jīng)T4 DNA連接酶連接成完整質(zhì)粒，命名為v-pTac-tpsp。構(gòu)建好載體后，將其轉(zhuǎn)化BW25113，命名為pTac-tpsp。

1.2.3 工程菌pTac-tpsp轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

從超低溫冰箱取出的菌種，在LB中活化后，然后按照1∶100接種至100 mL LB中，37 ℃下培養(yǎng)至600達(dá)到0.6–0.8時(shí)，添加0.5 mmol/L誘導(dǎo)劑IPTG，30 ℃誘導(dǎo)8 h。1) 轉(zhuǎn)化體系中菌體濃度和轉(zhuǎn)化時(shí)間：細(xì)菌經(jīng)誘導(dǎo)離心后收集菌體，用轉(zhuǎn)化液 (初始底物葡萄糖濃度為20 g/L) 重懸菌體，使得轉(zhuǎn)化體系中最終600分別為5、10、15、20、25及30。2) 轉(zhuǎn)化液中底物濃度：根據(jù)1) 最佳結(jié)果而定，分別使用含有5、10、15、20、25 g/L葡萄糖的轉(zhuǎn)化液。3) 優(yōu)化轉(zhuǎn)化溫度：使用前兩步優(yōu)化條件，使用不同的轉(zhuǎn)化溫度 (25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃)。以上實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化時(shí)間均為12 h，轉(zhuǎn)化完成后檢測(cè)上清中海藻糖的含量。

1.2.4 工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵

從超低溫冰箱拿出來的菌種，在LB中活化后，以1∶100接種至發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基中，過夜。第2天按照1∶100轉(zhuǎn)接到發(fā)酵罐中，待葡萄糖消耗完全以后，開始補(bǔ)糖。待菌體密度達(dá)到600為20時(shí)，添加0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃開始誘導(dǎo)，大約8 h后，發(fā)酵液用5 000 r/min (Eppendorf 5804R，轉(zhuǎn)子半徑15 cm) 離心20 min，去除上清，收集菌體，使用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.2.5 海藻糖樣品的制備和含量分析

轉(zhuǎn)化液12 000 r/min離心10 min后，分為全菌和上清兩個(gè)部分，直接取150 μL上清加150 μL ddH2O和700 μL乙腈，混勻后過濾，即為上清樣品。全菌使用1 mL的超純水重懸后，沸水浴30 min， 12 000 r/min離心10 min，取150 μL上清加150 μL ddH2O和700 μL乙腈，混勻后過濾，即為全菌樣品。HPLC檢測(cè)時(shí)使用70%乙腈為流動(dòng)相，流速1 mL/min，上樣10 μL，采用RID檢測(cè)器，柱溫和檢測(cè)器溫度均為35 ℃，色譜柱為安捷倫ZORBX NH2。

2 結(jié)果

2.1基因的克隆與功能性表達(dá)

以基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，電泳分析，得到一條約2 200 bp的條帶，結(jié)果如圖1A所示，其大小與理論的大小相吻合。然后將其與表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)鑒定無誤后，轉(zhuǎn)化BW25113，再經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)分析，結(jié)果如圖1B所示。箭頭指向?yàn)槟康牡鞍讞l帶，其大小為84.45 kDa，與預(yù)期相吻合。

圖1 C. hutchinsoniitpsp基因的克隆(A) 和在BW25113 (B)中的表達(dá)

為檢驗(yàn)表述的TPSP是否有功能，我們將誘導(dǎo)后的菌體使用轉(zhuǎn)化液重懸，添加2%葡萄糖和1 mmol/L的井岡霉素，30 ℃轉(zhuǎn)化后，分別取胞內(nèi)和胞外的樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)工程菌株pTac-tpsp的海藻糖產(chǎn)量，胞外為對(duì)照菌的6.3倍，胞內(nèi)為對(duì)照菌的2.3倍，因此雙功能酶TPSP可在中功能性表達(dá)，且海藻糖主要分泌在胞外。

2.2 轉(zhuǎn)化體系中生長(zhǎng)密度對(duì)糖轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)化中并非菌體量越大對(duì)生物轉(zhuǎn)化就越有利。圖2A為轉(zhuǎn)化體系中菌體600對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。從圖中可以看出600為20，轉(zhuǎn)化時(shí)間為12 h時(shí)，海藻糖的產(chǎn)量最高，達(dá)0.6 g/L。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)化能否將葡萄糖徹底消耗，我們?nèi)〔煌瑫r(shí)間點(diǎn)的樣品檢測(cè)葡萄糖的殘留量，如圖2B所示，使用600為20的菌體密度時(shí)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化24 h時(shí)葡萄糖已經(jīng)消耗殆盡，發(fā)酵液中的糖分只剩下海藻糖。

2.3 轉(zhuǎn)化體系中底物濃度對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化的影響

轉(zhuǎn)化體系中，葡萄糖濃度也是一個(gè)至關(guān)重要的因素，因?yàn)闈舛忍蜁?huì)使得菌體沒有足夠的底物合成海藻糖，而濃度太高，過多的海藻糖會(huì)影響的生理代謝。圖3A為底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，從結(jié)果中可以看出，當(dāng)葡萄糖濃度在10 g/L的時(shí)候，海藻糖積累量最高，達(dá)到0.92 g/L。

2.4 轉(zhuǎn)化溫度對(duì)海藻糖積累的影響

酶催化反應(yīng)對(duì)溫度比較敏感，溫度過高或者偏低都不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。由圖3B可以看出，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，海藻糖的積累量最高，達(dá)到1.20 g/L。

2.5 發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵罐中當(dāng)菌體密度達(dá)到600值為40的時(shí)候，單位時(shí)間的轉(zhuǎn)化效率較高，可能是因?yàn)榘l(fā)酵罐中可以實(shí)時(shí)監(jiān)控并且調(diào)節(jié)溶氧和pH，因此我們使用的菌體密度為600=40。轉(zhuǎn)化以后每隔一段時(shí)間取樣，檢測(cè)海藻糖的產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，維持葡萄糖濃度在10–15 g/L的情況下，在前30 h的海藻糖的合成量在升高，最終產(chǎn)量達(dá)到13.3 g/L。

圖2 E. coli菌體生長(zhǎng)密度 (A) 和轉(zhuǎn)化時(shí)間(B)對(duì)海藻糖產(chǎn)量的影響

圖3 TPSP轉(zhuǎn)化E. coli體系中葡萄糖濃度 (A) 和發(fā)酵培養(yǎng)溫度(B)對(duì)海藻糖生產(chǎn)的影響

3 討論

目前的研究表明具有5條海藻糖合成途徑，分別為OtsBA[14]、TreP[15]、TreS[16]、TreT[17]和TreYZ[18]途徑。其中使用otsBA途徑合成海藻糖還停留在過表達(dá)OtsA和OtsB兩個(gè)酶，比如，Li等[7]在DH5α中過表達(dá)MG1665的基因，通過優(yōu)化，海藻糖的產(chǎn)量達(dá)到了1.7 g/L，Kong等[19]對(duì)基因進(jìn)行定向進(jìn)化，使該途徑的酶活提高了12.3倍，達(dá)到12.77 mg/g細(xì)胞。但是研究表明酶之間的物理距離影響著代謝途徑的效率，因此本實(shí)驗(yàn)首次將來源于的雙功能酶TPSP在中實(shí)現(xiàn)功能性表達(dá)。結(jié)果表明，經(jīng)過優(yōu)化以后，在搖瓶水平上，海藻糖的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到1.2 g/L，相對(duì)轉(zhuǎn)化率為21% (相對(duì)轉(zhuǎn)化率為實(shí)際轉(zhuǎn)化率占理論轉(zhuǎn)化率的比重，理論轉(zhuǎn)化率為57%)，在發(fā)酵罐中，產(chǎn)量為13.3 g/L，相對(duì)轉(zhuǎn)化率為48.6%。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Construction of a recombinantfor high trehalose production

Chao Gao1, Shan Zhang2, Yongzhi He2, Jianzhong Huang1, and Zhiyang Dong2

1 Engineering Research Center of Fujian Modern Fermentation Technology, Engineering Research Center of Industrial Microbiology, Ministry of Education, College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China2 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Trehalose, a compatible solute, is widely used in food, cosmetics, pharmaceutical products and organ transplantation. Nowadays, trehalose is mostly produced by enzymatic synthesis with many secondary products and low purity. In this study, high amount of trehalose was produced by recombinantfermentation. First, a bifunctional trehalose gene TPSP was amplified from genome of. Second, an expression vector pTac-HisA containing TPSP was constructed and transformed into the host. Expression of this bifunctional enzyme-TPSP converted glucose to trehalose. The result suggested that TPSP fromhas been successfully expressed in. High amount of extracellular trehalose generated from glucose by whole-cell catalysis and After optimization, the production of trehalose in shake flasks was improved to 1.2 g/L and the relative conversion rate reached 21%. The production in bioreactor reached 13.3 g/L and the relative conversion rate reached 48.6%. It is the first time to realize the functional expression of the bifunctional enzyme-TPSP ofinand achieved the conversion form glucose to trehalose. This study laid a foundation for industrial large-scale production of trehalose.

trehalose, bifunctional enzyme, trehalose synthase, whole-cell biocatalysis,, conditions optimization

February 3, 2015; Accepted:March 26, 2015

Zhiyang Dong. Tel: +86-10-64807337; E-mail: dongzy@im.ac.cnJianzhong Huang. Tel: +86-591-22868212; E-mail: hjz@fjnu.edu.cn

10.13345/j.cjb.150070

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31100066), National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2012AA02A703).

國家自然科學(xué)基金(No. 31100066)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (No. 2012AA02A703) 資助。

2015-05-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150513.1534.004.html