肖艷，陳獻(xiàn)忠，沈微，楊海泉，樊游

?

表面展示表達(dá)植酸酶的重組釀酒酵母構(gòu)建及酒精發(fā)酵

肖艷1,2，陳獻(xiàn)忠1,2，沈微1,2，楊海泉1,2，樊游1,2

1 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122 2 江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物資源與生物能源研究中心，江蘇無錫 214122

肖艷, 陳獻(xiàn)忠, 沈微, 等. 表面展示表達(dá)植酸酶的重組釀酒酵母構(gòu)建及酒精發(fā)酵. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(12): 1700–1710.Xiao Y, Chen XZ, Shen W, et al. Surface display of phytase on Saccharomyces cerevisiae for efficient bioethanol production from corn starch. Chin J Biotech, 2015, 31(12): 1700–1710.

以淀粉為原料的同步糖化發(fā)酵是目前乙醇生產(chǎn)的主要途徑之一。然而原料中含有的植酸不僅影響酒精發(fā)酵效率，而且也會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中難以被植物吸收的磷含量的增加，加劇環(huán)境污染。將來源于大腸桿菌的植酸酶基因與酵母編碼α-凝集素C端編碼序列連接并置于α-因子分泌信號(hào)肽下游，構(gòu)建植酸酶表面展示表達(dá)重組載體pMGK-AG-并轉(zhuǎn)化工業(yè)釀酒酵母，成功獲得了在細(xì)胞表面錨定表達(dá)植酸酶的重組菌PHY。重組酵母的植酸酶表達(dá)水平達(dá)到6.4 U/g (菌體濕重)，其最適溫度為55 ℃，最適pH 4.0，在pH 3.5–4.5范圍內(nèi)具有較高的活性。以玉米粉為原料的同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，重組酵母PHY的生長速度高于出發(fā)菌株，同時(shí)酒精產(chǎn)量相較于出發(fā)菌株提高了3.7%。更為重要的是發(fā)酵后酒糟中植酸磷含量與對(duì)照相比降低了91%。構(gòu)建的表面展示表達(dá)植酸酶的重組工業(yè)釀酒酵母能夠有效降低植酸含量，提高了酒糟的利用價(jià)值，減少磷排放，對(duì)燃料酒精的環(huán)境友好生產(chǎn)具有重要的借鑒意義。

釀酒酵母，表面展示，植酸酶，燃料酒精，α-凝集素

燃料酒精是一種可再生的清潔能源，國內(nèi)外生產(chǎn)燃料酒精的原料有玉米、甘薯、甘蔗、甜菜、高粱秸稈等，目前應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的主要是玉米類淀粉質(zhì)原料。利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)燃料酒精的方法主要有先糖化后發(fā)酵法、同步糖化發(fā)酵法和高濃度發(fā)酵法等，同步糖化發(fā)酵法具有發(fā)酵周期短[1]、工藝簡單、能耗低、醪液酒精濃度高等優(yōu)點(diǎn)，值得工業(yè)推廣[2]。酒精糟液的處理是燃料酒精生產(chǎn)中的一個(gè)關(guān)鍵工序，糟液中含有糖分、蛋白質(zhì)、纖維素、氨、磷、鉀等營養(yǎng)成分，經(jīng)濃縮處理后可用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料[3-4]。酒精糟液中的磷主要以植酸磷的形式存在，植酸磷是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，不能被動(dòng)物直接吸收利用，還會(huì)影響其他礦物元素的吸收[5]，不能被吸收的植酸磷隨動(dòng)物糞便排出體外后，還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染[6]。

釀酒酵母表面展示表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)愒窗械鞍自谛盘?hào)肽的引導(dǎo)下向胞外分泌，并借助酵母細(xì)胞內(nèi)的GPI錨定機(jī)制定位表達(dá)于酵母細(xì)胞表面[7]。釀酒酵母表面展示系統(tǒng)具有遺傳操作方便、適宜表達(dá)真核蛋白等優(yōu)點(diǎn)，是比較理想的展示系統(tǒng)[8]，在全細(xì)胞催化、蛋白純化、細(xì)胞吸附、抗體工程等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[9-10]。近幾年，利用表面展示技術(shù)改良釀酒酵母，拓展底物利用范圍提高酒精發(fā)酵性能方面取得了顯著的進(jìn)步。Shigechi等通過在酵母表面共展示米根霉葡萄糖糖淀粉酶和牛鏈球菌α-淀粉酶實(shí)現(xiàn)了利用不蒸煮粗玉米淀粉生產(chǎn)乙醇的新工藝[11]。Fujita等構(gòu)建了共表達(dá)針尾曲霉的β-葡聚糖苷酶、里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的重組酵母，利用同步糖化發(fā)酵，將無定形纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇[12]。

植酸酶能夠催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸(鹽)，同時(shí)釋放出與植酸(鹽) 結(jié)合的其他營養(yǎng)物質(zhì)，該酶能夠提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值，在動(dòng)物飼料生產(chǎn)工業(yè)中具有重要的作用[13]。在酒精發(fā)酵生產(chǎn)中，添加植酸酶能夠促進(jìn)酵母的發(fā)育及代謝，提高酒精生產(chǎn)效率，同時(shí)降低酒糟中的植酸磷含量，提高其飼用價(jià)值，保護(hù)環(huán)境[14]。Fujita等在清酒酒曲中加入了表達(dá)植酸酶的米曲霉，用該酒曲進(jìn)行的酒精發(fā)酵得到促進(jìn)，最終酒精產(chǎn)量提高了0.5% (/)[15]。許宏賢等在高粱生料酒精發(fā)酵過程中添加植酸酶，清液和酒糟中的植酸含量明顯降低，提高了酒糟作為飼料的營養(yǎng)價(jià)值[16]。Khullar等在干磨法酒精生產(chǎn)中添加植酸酶，酒精產(chǎn)量從16.6%提高到17.4% (/)，植酸酶的添加還使酒精生產(chǎn)副產(chǎn)物酒糟蛋白飼料(DDGS) 有較高的蛋白質(zhì)含量和較低的淀粉含量，分別從34.2%和8.14%變?yōu)?6.5%和6.58%[17]。Mikulski等在淀粉水解前及水解后分別添加植酸酶，淀粉酶的水解作用得到促進(jìn)，發(fā)酵初始糖濃度平均提高了14.9 g/L，酒精產(chǎn)量分別增加了1.0%和0.6% (/)[18]。

本文將大腸桿菌的植酸酶基因與酵母α-凝集素C端編碼序列連接并置于α-分泌信號(hào)肽(Secretion signal) 下游，構(gòu)建表面展示植酸酶的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化釀酒酵母，獲得了在細(xì)胞表面錨定表達(dá)植酸酶的重組酵母PHY。該重組酵母在以玉米粉為原料的同步糖化發(fā)酵中，表現(xiàn)出優(yōu)于出發(fā)菌株的發(fā)酵性能，更為重要的是發(fā)酵后酒糟中植酸磷含量與對(duì)照相比降低了91%。目前，我國年產(chǎn)玉米酒糟350萬t左右，其中大部分用作畜禽飼料[19]。本文構(gòu)建的表面展示表達(dá)植酸酶的重組酵母應(yīng)用酒精工業(yè)生產(chǎn)，不僅能有效水解植酸磷，提高全價(jià)干酒糟的飼用價(jià)值，而且也會(huì)減少有機(jī)磷的排放。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌JM109用于質(zhì)粒構(gòu)建，工業(yè)釀酒酵母CICIMY0086用于酵母轉(zhuǎn)化宿主，以上菌種均由江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源與信息中心保藏。pMD18-T載體購自TaKaRa公司，用于目的基因的克隆和測序；質(zhì)粒pPIC9K由本實(shí)驗(yàn)室保藏，用于克隆酵母分泌信號(hào)肽；含有密碼子優(yōu)化后的植酸酶基因的重組質(zhì)粒pKK322-和酵母表面展示載體pMGK-AG為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，用于目的基因在釀酒酵母表面的展示。

1.2 酶和試劑

核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA聚合酶等分子克隆工具酶均為大連寶生物工程公司產(chǎn)品；G418購自生工生物工程(上海) 有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；酶特異性底物果膠及植酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品；發(fā)酵用玉米粉為市售，淀粉含量為70%；耐高溫α-淀粉酶及糖化酶為江蘇銳陽生物科技有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1%氯化鈉，37 ℃用于的培養(yǎng)。添加100 μg/mL的氨芐青霉素用于重組菌的篩選。

YPD培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，30 ℃用于的培養(yǎng)。添加300 μg/mL的G418用于重組酵母的篩選。

種子培養(yǎng)基：2%葡萄糖，0.85%酵母粉，0.13%氯化銨，0.01%硫酸鎂，0.006%氯化鈣，30 ℃用于釀酒酵母發(fā)酵前的種子培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：按1∶3 (/) 的比例將玉米粉與去離子水混合，調(diào)pH至6.0，加入耐高溫α淀粉酶(10 U/g)。加熱料液至95 ℃，維持2 h。降至室溫后調(diào)pH至4.5，添加去離子水以彌補(bǔ)水分損失。高壓蒸汽滅菌，降溫后加入糖化酶(130 U/g) 和尿素(終濃度0.05%)。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

重組質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1所示。根據(jù)植酸酶基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物1 (5?-CAGAGTGA GCCTGAGTTGAAA-3?) 和2 (5?-CCGTTACTACAAGGAACAAGCTGG-3?，下劃線為RⅠ酶切位點(diǎn))，以重組質(zhì)粒pKK322-為模板，PCR擴(kuò)增得到不含自身信號(hào)肽的植酸酶基因。將擴(kuò)增得到的基因用補(bǔ)平后與BⅠ酶切后的質(zhì)粒pPIC9k連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9k-。以P1 (5?-CCGCGA TGAGATTTCCTTCAA-3?，下劃線為RⅠ酶切位點(diǎn)) 和2為引物PCR擴(kuò)增得到含信號(hào)肽的s基因，RⅠ酶切后用核酸酶S1處理得到平末端片段，同樣方法處理表面展示載體pMGK-AG，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，得到表達(dá)載體pMGK-AG-。

1.5 工業(yè)釀酒酵母的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

重組質(zhì)粒用Ⅱ酶切線性化，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化工業(yè)釀酒酵母，轉(zhuǎn)化液涂布含有300 μg/mL G418的YPD 平板，30 ℃培養(yǎng)48 h。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子提取染色體DNA，PCR擴(kuò)增篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.6 酶活力測定方法

將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株分別接種10 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 d，12 000 r/min離心30 s收集菌體，用乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0) 洗滌2次，重懸菌體，進(jìn)行植酸酶酶活力測定。為進(jìn)一步判斷植酸酶的表達(dá)位置，分別取上清液和超聲波破碎后的細(xì)胞重懸液進(jìn)行酶活力測定。

植酸酶酶活測定采用鉬藍(lán)法，具體操作如下：將800 μL 6.25 mmol/L的植酸鈉溶液37 ℃預(yù)熱10 min，加入200 μL待測酶液，37 ℃反應(yīng)30 min，立即加入1 mL 5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，加入 1 mL顯色液(1.5%鉬酸銨溶液，2.7%硫酸亞鐵，4∶1比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配)，室溫下靜置10 min，8 000 r/min離心5 min，測定其在700 nm處的吸光值[20]。酶活定義為：在37 ℃、pH 5.0條件下，每分鐘從5.0 mmol/L植酸鈉溶液中釋放出1 μmol的無機(jī)磷所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

為評(píng)價(jià)重組植酸酶的最適pH，分別在pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5.、6.0、6.5、7.0和7.5 (0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉作為pH緩沖液)，pH 7.0、7.5、8.0、8.5和9.0 (50 mmol/L Tris-HC1作為pH緩沖液) 條件下，37 ℃反應(yīng)30 min，然后用鉬藍(lán)法測定植酸酶酶活力。

1.7 重組工業(yè)釀酒酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將篩選到的重組工業(yè)釀酒酵母與出發(fā)菌株分別接種10 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，1%接種量轉(zhuǎn)接50 mL YPD培養(yǎng)基，每隔2 h取樣，在波長600 nm下測吸光值，測定其生長曲線。

圖1 重組質(zhì)粒pPIC9k-phy和pMGK-AG-phy的構(gòu)建

將重組工業(yè)釀酒酵母和出發(fā)菌株分別接種于20 mL種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng) 12 h，以1%的接種量轉(zhuǎn)接新的種子培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，作為發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的種子液。發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為135 mL，接種量為10%，30 ℃靜置發(fā)酵，每隔8 h取樣，發(fā)酵56 h。為保證數(shù)據(jù)可靠性，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。

為進(jìn)一步驗(yàn)證植酸酶在酒精發(fā)酵中的作用，進(jìn)行了外源添加植酸酶的工業(yè)釀酒酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵方法同上。

用高效液相色譜分析發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗和酒精的產(chǎn)生，色譜柱為Aminex HPX-87H 離子交換柱，流動(dòng)相為10 mmol/L H2SO4，流速0.8 mL/min，柱溫65 ℃[21]；發(fā)酵初始的總糖采用酸水解法測定，DNS法測還原糖，以公式計(jì)算發(fā)酵效率：發(fā)酵效率=實(shí)測發(fā)酵酒精濃度/(初始總糖濃度×0.511)×100%。

實(shí)驗(yàn)所用發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉，雜質(zhì)較多，不宜直接測定生物量。核酸在細(xì)胞中的含量十分穩(wěn)定，在代謝上也較為穩(wěn)定，與菌體量具有良好的線性關(guān)系[22]，故用菌體內(nèi)的核酸含量表示其菌體量，測定方法如下：取1 mL發(fā)酵液離心水洗，在沉淀中加預(yù)冷的10%三氯乙酸1 mL，混勻，冰水浴中放置2 min，離心棄上清，沉淀中加冷的5%三氯乙酸1 mL，混勻，沸水浴中加熱30 min，冷卻離心，取上清0.1 mL稀釋至5 mL，混勻后在波長260 nm處測吸光值，菌體核酸量(g/L)=×1.72[23]。植酸磷含量測定采用沉淀消解法，取1 g烘干后的發(fā)酵混合物，加入1.2%的鹽酸50 mL，200 r/min振蕩1 h，定性濾紙過濾，取10 mL濾液，加入1%的三氯化鐵4 mL，沸水浴30 min，冷卻后離心去上清，向沉淀物中加入5 mL濃硝酸和2 mL濃硫酸，加熱消解至沉淀全部溶解，定容至100 mL；取定容后的消解液10 mL，加入0.8 mol/L濃硫酸4 mL、10 %鉬酸銨0.4 mL、去離子水30 mL，搖勻后加入2%抗壞血酸0.5 mL，定容至50 mL，顯色20 min，波長660 nm處測定吸光值[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

表面展示表達(dá)植酸酶的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程見圖1。首先，以質(zhì)粒pKK322-為模板，1和2為引物，擴(kuò)增得到大小為1 236 bp的來源于大腸桿菌并經(jīng)密碼子優(yōu)化的植酸酶基因，將該片段與載體pPIC9k連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k-。用限制性內(nèi)切酶Ⅰ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，得到大小為2 930 bp和7 588 bp的條帶，酶切驗(yàn)證正確(圖2A)。

以重組質(zhì)粒pPIC9k-為模板，P1和2為引物擴(kuò)增得到大小為1 508 bp的含信號(hào)肽的s基因，將該片段與表面展示載體pMGK-AG連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，構(gòu)建表達(dá)載體pMGK-AG-。用限制性內(nèi)切酶d Ⅲ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，得到大小為1 056 bp、3 940 bp和5 729 bp的條帶，酶切驗(yàn)證正確 (圖2B)。

2.2 重組工業(yè)釀酒酵母的構(gòu)建及酶活測定

重組質(zhì)粒pMGK-AG-用Ⅱ酶切線性化后轉(zhuǎn)化工業(yè)釀酒酵母，轉(zhuǎn)化液涂布于添加了300 μg/mL G418的YPD固體平板，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子提取染色體DNA，以1和2為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。pMGK-AG-轉(zhuǎn)化子在1 236 bp處出現(xiàn)條帶，以出發(fā)菌株染色體DNA為模板PCR擴(kuò)增未得到任何片段 (圖2C)。

挑取陽性轉(zhuǎn)化子與出發(fā)菌株分別接種于YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行植酸酶酶活力測定。7#轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞懸液測得植酸酶酶活為6.4 U/g (菌體濕重)，該菌株命名為PHY；出發(fā)菌株中未測得任何酶活，說明植酸酶基因整合在酵母染色體上并成功表達(dá)；7#轉(zhuǎn)化子

細(xì)胞重懸液經(jīng)超聲波破碎后酶活為5.8 U/g，且轉(zhuǎn)化子上清液中沒有檢測到酶活，說明植酸酶在酵母細(xì)胞表面錨定表達(dá)。

2.3 重組植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 重組植酸酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

由圖3A可知，重組酶的最適溫度為55 ℃，溫度低于55 ℃時(shí)，酶活隨溫度上升而上升，30 ℃時(shí)的酶活僅為55 ℃時(shí)的17%，當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí)，酶活迅速下降，60 ℃及65 ℃時(shí)保留有60%的酶活。

將收集的重組細(xì)胞在30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃分別保溫1–6 h，測定重組酶的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3B所示。樣品在30 ℃時(shí)具有極好的穩(wěn)定性，保溫6 h，比酶活仍在98%以上；40 ℃時(shí)樣品穩(wěn)定性依然良好，保溫6 h，比酶活在85%以上；酶活在45 ℃及50 ℃保溫過程中逐漸下降，保溫3 h，樣品保留60%以上的酶活，保溫6 h，比酶活分別為43%和28%；樣品在55 ℃和60 ℃保溫過程中酶活下降較快，保溫1 h，比酶活分別降至45%、7%。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證及釀酒酵母轉(zhuǎn)化子的菌落PCR鑒定

圖3 表面展示植酸酶的最適溫度(A) 和溫度穩(wěn)定性(B)

2.3.2 重組植酸酶的最適pH

由圖4可知，表面展示的重組植酸酶在酸性條件下酶活較高，在pH 3.5–4.5之間酶活力較高，保持在80%以上，pH 4.0時(shí)酶活力達(dá)到最高。當(dāng)pH低于3.5或高于4.5時(shí)酶活力迅速下降，當(dāng)pH為堿性條件時(shí)酶活力喪失殆盡。釀酒酵母適宜在酸性環(huán)境中生長，酒精發(fā)酵的最適pH在4–5范圍[25]，重組酶最適pH分析結(jié)果表明該酶適合于釀酒酵母的酒精發(fā)酵環(huán)境。

2.4 重組工業(yè)釀酒酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.4.1 YPD培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵

將重組酵母PHY與出發(fā)菌株分別接種于YPD培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min條件下測定其生長曲線，菌體生長情況如圖5所示，6–10 h為對(duì)數(shù)生長期，重組酵母PHY的生長速率略快于出發(fā)菌株，發(fā)酵12 h后達(dá)到穩(wěn)定，出發(fā)菌株600最大在7.32左右，重組酵母PHY最大在7.38左右，說明重組酵母在YPD培養(yǎng)基中的菌體生長情況并沒有顯著變化。

圖4 表面展示植酸酶的最適pH

圖5 出發(fā)菌株和重組酵母PHY在YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵的生長曲線

2.4.2 重組酵母PHY和出發(fā)菌株在玉米粉培養(yǎng)基中的生長和發(fā)酵性能比較

如圖6所示，發(fā)酵前期，核酸量快速增長，菌體生長迅速，發(fā)酵中后期隨乙醇濃度的上升，菌體生長受到抑制，核酸量逐漸趨于穩(wěn)定。重組酵母PHY及外源添加植酸酶的出發(fā)菌株發(fā)酵過程中的核酸量高于出發(fā)菌株，發(fā)酵40 h核酸量達(dá)到最大，出發(fā)菌株最大核酸量為0.72 g/L，重組酵母PHY最大核酸量為0.76 g/L，外源添加植酸酶的出發(fā)菌株最大生物量為0.74 g/L，重組酵母在玉米粉培養(yǎng)基中的核酸量高于出發(fā)菌株，說明其菌體生長情況優(yōu)于出發(fā)菌株。

如圖7所示，重組酵母PHY酒精生產(chǎn)速率與出發(fā)菌株相當(dāng)，發(fā)酵48 h，酒精產(chǎn)量最高為112 g/L，與對(duì)照菌株相比，酒精產(chǎn)量(108 g/L)提高了3.7%，而外源添加植酸酶的發(fā)酵結(jié)果也表明酒精產(chǎn)量有一定程度提高。發(fā)酵初始的總糖濃度為245 g/L，重組酵母PHY及出發(fā)菌株的發(fā)酵效率分別為90.25%和85.5%；發(fā)酵前8 h，葡萄糖濃度有明顯上升，是由于糖化酶持續(xù)水解淀粉糊精，生產(chǎn)葡萄糖，重組酵母PHY發(fā)酵過程中的葡萄糖消耗速率略快于出發(fā)菌株。外源添加植酸酶的出發(fā)菌株發(fā)酵情況與植酸酶重組酵母表現(xiàn)相似，酒精產(chǎn)量和葡萄糖消耗速率略快于出發(fā)菌株，但差距不大。

圖6 出發(fā)菌株、重組酵母PHY及外源添加植酸酶的出發(fā)菌株在玉米粉培養(yǎng)基中發(fā)酵的核酸生物量

以植酸磷的形式存在于酒糟中的磷元素的生物可利用性較低，其植酸磷含量高低不僅顯著影響著酒糟作為動(dòng)物飼料的營養(yǎng)價(jià)值，而且還影響環(huán)境的磷排放量[26]。我們?cè)u(píng)價(jià)了重組酵母酒精發(fā)酵過程中植酸磷含量變化，結(jié)果如圖8所示。發(fā)酵前期，出發(fā)菌株發(fā)酵液固形物中植酸磷含量有所升高是由于隨發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵液中固形物比例減少，植酸磷得到濃縮。重組酵母PHY及外源添加植酸酶的出發(fā)菌株發(fā)酵液固形物中的植酸磷含量明顯降低。出發(fā)菌株發(fā)酵結(jié)束后的干酒糟中植酸磷含量為0.68%，而重組酵母PHY發(fā)酵后干酒糟中的植酸磷含量僅0.06%，降低了91%，外源添加植酸酶的出發(fā)菌株發(fā)酵后干酒糟中的植酸磷含量也相應(yīng)降低。

圖8 出發(fā)菌株、重組酵母PHY及外源添加植酸酶的出發(fā)菌株在玉米粉培養(yǎng)基中發(fā)酵過程中固形物中的植酸磷含量的變化圖

結(jié)果表明利用表面展示植酸酶的重組釀酒酵母酒精發(fā)酵顯著降低了酒糟中的植酸和植酸磷含量，提高了酒糟的飼用價(jià)值，同時(shí)有利于減少有機(jī)磷的排放。但是重組植酸酶活性較低，而且重組酵母菌對(duì)酒精發(fā)酵性能的提升也很微弱。分析其原因，一方面可能是來源于細(xì)菌的植酸酶基因不適宜于酵母表達(dá)系統(tǒng)，或者啟動(dòng)子強(qiáng)度較弱導(dǎo)致重組酶的表達(dá)活力較低；另一方面，構(gòu)建整合型表達(dá)植酸酶的重組質(zhì)粒盡管提高了重組菌的穩(wěn)定性，但一定程度上限制了植酸酶基因拷貝數(shù)，從而導(dǎo)致了較低的重組酶活。另外，深入分析植酸分解導(dǎo)致的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的改變以及優(yōu)化相應(yīng)發(fā)酵工藝也是提高酒精發(fā)酵性能的可能途徑，值得進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究通過PCR技術(shù)克隆了大腸桿菌的植酸酶基因，并將其展示于工業(yè)釀酒酵母細(xì)胞表面。重組酵母PHY植酸酶酶活力達(dá)到6.4 U/g。表面展示的植酸酶在pH 3.5–4.5條件下酶活力較高，符合釀酒酵母發(fā)酵要求。重組酵母PHY在玉米粉培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵，酒精產(chǎn)量提高了3.7%，發(fā)酵過程中，重組酵母PHY發(fā)酵液固形物中植酸磷含量顯著降低，發(fā)酵后干酒糟中植酸磷含量相比出發(fā)菌株降低了91%，為提高全價(jià)酒糟的利用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)有利于減少環(huán)境中有機(jī)磷的排放。

[1] Montesinos T, Navarro JM. Production of alcohol from raw wheat flour by amyloglucosidase and. Enzyme Microb Technol, 2000, 27(6): 362–370.

[2] Liu Z, Wang JP, Zhang LF, et al. Production of ethanol by simultaneous saccharifiction and fermentation from cassava. Chin J Process Eng, 2005, 5(3): 353–356 (in Chinese). 劉振, 王金鵬, 張立峰, 等. 木薯干原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇. 過程工程學(xué)報(bào), 2005, 5(3): 353–356.

[3] Welker TL, Lim C, Barrows FT, et al. Use of distiller's dried grains with solubles (DDGS) in rainbow trout feeds. Anim Feed Sci Technol, 2014, 195: 47–57.

[4] Nade T, Uchida K, Omori K, et al. The effects of feeding a low level of distiller's dried grains with solubles ( DDGS) to yearling Holstein steers. Anim Sci J, 2013, 84(6): 476–482.

[5] Ray PP, Shang C, Pearson RE, et al. Disappearance of infused phytate from the large intestine of dairy heifers. J Dairy Sci, 2012, 95(10): 5927–5935.

[6] Mullaney EJ, Daly CB, Ullah AH. Advances in phytase research. Adv Appl Microbiol, 2000, 47: 157–199.

[7] Lee SY, Choi JH, Xu ZH. Microbial cell-surface display. Trends Biotechnol, 2003, 21(1): 45–52.

[8] Kondo A, Ueda M. Yeast cell-surface display-applications of molecular display. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64(1): 28–40.

[9] Blaise L, Wehnert A, Steukers MPG, et al. Construction and diversification of yeast cell surface displayed libraries by yeast mating: application to the affinity maturation of Fab antibody fragments. Gene, 2004, 342(2): 211–218.

[10] Gai SA, Wittrup KD. Yeast surface display for protein engineering and characterization. Curr Opin Struct Biol, 2007, 17(4): 467–473.

[11] Shigechi H, Fujita Y, Koh J, et al. Energy-saving direct ethanol production from low-temperature- cooked corn starch using a cell-surface engineered yeast strain co-displaying glucoamylase and α-amylase. Biochem Eng J, 2004, 18(2): 149–153.

[12] Fujita Y, Takahashi S, Ueda M, et al. Direct and efficient production of ethanol from cellulosic material with a yeast strain displaying cellulolytic enzymes. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(10): 5136–5141.

[13] Haefner S, Knietsch A, Scholten E, et al. Biotechnological production and applications of phytases. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 68(5): 588–597.

[14] Shetty JK, Paulson B, Pepsin M, et al. Phytase in fuel ethanol production offers economical and environmental benefits. Int Sugar J, 2008, 110(1311): 160–174.

[15] Fujita J, Fukuda H, Yamane YI, et al. Critical importance of phytase for yeast growth and alcohol fermentation in Japanesebrewing. Biotechnol Lett, 2001, 23(11): 867–871.

[16] Xu HX, Ran ZH, Duan G. Application of phytase in non-cooked fermentation of sorghum for ethanol production. Food Sci, 2010, 31(5): 248–251 (in Chinese). 許宏賢, 阮振華, 段鋼. 高粱生料酒精發(fā)酵植酸酶的應(yīng)用研究. 食品科學(xué), 2010, 31(5): 248–251.

[17] Khullar E, Shetty JK, Rausch KD, et al. Use of phytases in ethanol production from E-Mill corn processing. Cereal Chem, 2011, 88(3): 223–227.

[18] Mikulski D, K?osowski G, Rolbiecka A. Effect of phytase application during high gravity (HG) maize mashes preparation on the availability of starch and yield of the ethanol fermentation process. Appl Biochem Biotechnol, 2014, 174(4): 1455–1470.

[19] Li P. Determination and prediction of energy and amino acid digestibility in different processing corn distillers dried grains with solubles of China fed to growing pigs [D]. Beijing: China Agricultural University, 2014 (in Chinese). 李平. 國產(chǎn)不同生產(chǎn)工藝玉米DDGS生長豬能量與氨基酸消化率研究[D]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[20] Sanikommu S, Pasupuleti M, Vadalkonda L. Comparison of phosphate estimating methods in the presence of phytic acid for the determination of phytase activity. Prep Biochem Biotechnol, 2014, 44(3): 231–241.

[21] Guo ZP. Metabolic engineering of an industrial ethanol producing yeast to improve its fermentation performance[D]. Wuxi: Jiangnan University, 2011 (in Chinese).郭忠鵬. 代謝工程改善工業(yè)酒精酵母發(fā)酵性能[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2011.

[22] Koliander B, Hampel W, Roehr M. Indirect estimation of biomass by rapid ribonucleic acid determination. Appl Microbiol Biotechnol, 1984, 19(4): 272–276.

[23] Prasetyo J, Zhu J, Kato T, et al. Efficient production of cellulase in the culture ofusing untreated waste paper sludge. Biotechnol Prog, 2011, 27(1): 104–110.

[24] Lorenz AJ, Scott MP, Lamkey KR. Quantitative determination of phytate and inorganic phosphorus for maize breeding. Crop Sci, 2006, 47(2): 600–606.

[25] Zhu GJ, Li HZ. Microbiology. Beijing: Science Press, 2009: 284–285 (in Chinese). 諸葛健, 李華鐘. 微生物學(xué). 北京: 科學(xué)出版社, 2009: 284–285.

[26] Liu KS. Chemical composition of distillers grains, a review. J Agric Food Chem, 2011, 59(5): 1508–1526.

(本文責(zé)編郝麗芳)

Surface display of phytase onfor efficient bioethanol production from corn starch

Yan Xiao1,2, Xianzhong Chen1,2, Wei Shen1,2, Haiquan Yang1,2, and You Fan1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China2 Center of Bioresource & Bioenergy, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Production of bioethanol using starch as raw material has become a very prominent technology. However, phytate in the raw material not only decreases ethanol production efficiency, but also increases phosphorus discharge. In this study, to decrease phytate content in an ethanol fermentation process,was engineered for heterologous expression of phytase on the cell surface. Thegene encoding phytase gene was fused with the C-terminal-half region of α-agglutinin and then inserted downstream of the secretion signal gene, to produce a yeast surface-display expression vector pMGK-AG-, which was then transformed into. The recombinant yeast strain, PHY, successfully displayed phytase on the surface of cells producing 6.4 U/g wet cells and its properties were further characterized. The growth rate and ethanol production of the PHY strain were faster than the parentstrain in the fermentation medium by simultaneous saccharification and fermentation. Moreover, the phytate concentration decreased by 91% in dry vinasse compared to the control. In summary, we constructed recombinantstrain displaying phytase on the cell surface, which could effectively reduce the content of phytate, improve the utilization value of vinasse and reduce the discharge of phosphorus. The strain reported here represents a useful novel engineering platform for developing an environment-friendly system for bioethanol production from a corn substrate.

, surface display, phytase, bioethanol, α-agglutinin

January 19, 2015; Accepted:April 22, 2015

Xianzhong Chen. Tel/Fax: +86-510-85918122; E-mail: xzchen@jiangnan.edu.cn

10.13345/j.cjb.150032

Supported by:The Science and Technology Support Program of Jiangsu Province (No. BE2012618).

江蘇省科技支撐計(jì)劃社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目 (No. BE2012618) 資助。