伍林軍，范可強(qiáng)，季俊杰，楊克遷

?

高濃度底物下青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的活性評(píng)價(jià)與底物抑制現(xiàn)象

伍林軍1,2，范可強(qiáng)1，季俊杰1，楊克遷1

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所微生物資源前期開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

伍林軍, 范可強(qiáng), 季俊杰, 等. 高濃度底物下青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶的活性評(píng)價(jià)與底物抑制現(xiàn)象. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(12): 1690–1699.Wu LJ, Fan KQ, Ji JJ, et al. Evaluation of penicillin expandase mutants and complex substrate inhibition characteristics at high concentrations of penicillin G. Chin J Biotech, 2015, 31(12): 1690–1699.

本文對(duì)青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶(Penicillin expandase，也稱Deacetoxycephalosporin C synthase，DAOCS) 在高濃度青霉素G下的底物抑制現(xiàn)象進(jìn)行初步評(píng)價(jià)與表征，篩選適合工業(yè)應(yīng)用條件的高活力突變體。我們通過(guò)HPLC對(duì)已報(bào)道的幾個(gè)DAOCS高活力突變體在青霉素G濃度5.6至500 mmol/L間的比活力進(jìn)行定量測(cè)定，并與不同催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型的理論推測(cè)變化趨勢(shì)比較，發(fā)現(xiàn)DAOCS野生型酶及高活力突變體H4、H5、H6與H7在高濃度青霉素G條件下均表現(xiàn)出明顯的底物抑制現(xiàn)象，但是變化趨勢(shì)不同。野生型酶與突變體H4的比活力先上升后下降，與競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型預(yù)測(cè)不符。突變體H5、H6與H7的比活力變化呈現(xiàn)更復(fù)雜的變化趨勢(shì)。在所有測(cè)試的突變體中，H6的活性顯著高于其他突變體酶。青霉素G對(duì)野生型DAOCS的底物抑制現(xiàn)象符合非競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型的預(yù)測(cè)。而部分突變體表現(xiàn)出復(fù)雜的底物抑制行為，表明其具有更復(fù)雜的作用機(jī)制。在高底物濃度下篩選具有較強(qiáng)催化活性的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶突變體對(duì)于推動(dòng)其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)作用。

去乙酰氧頭孢菌素C合成酶，底物抑制，高濃度青霉素G

青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶 (Penicillin expandase，也稱Deacetoxycephalosporin C synthase，DAOCS) 是非血紅素Fe2+和α-酮戊二酸依賴的氧化酶，它催化青霉素的五元噻唑環(huán)擴(kuò)環(huán)生成六元噻嗪環(huán)，這是由青霉素及其類似物合成具有重要醫(yī)療價(jià)值的頭孢類化合物中間體的關(guān)鍵步驟[1-2](圖1)。棒狀鏈霉菌中編碼該酶 (scDAOCS) 的基因?yàn)閇3-4]。由于DAOCS具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景，對(duì)其已有多年的研究基礎(chǔ)，特別是在通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造拓寬其底物范圍、提高其活力等方面已取得許多進(jìn)展。

DAOCS的天然底物是青霉素N，而對(duì)其他青霉素類化合物的活性非常低。直到1998年，Cho等提高了反應(yīng)體系中Fe2+和α-酮戊二酸的濃度，才探索出了DAOCS對(duì)其他青霉素類似物 (包括青霉素G) 成功進(jìn)行擴(kuò)環(huán)反應(yīng)的體系[5]。在他們的體系下，棒狀鏈霉菌NP1靜息態(tài)細(xì)胞可成功催化青霉素N以及其他14種青霉素類似物發(fā)生擴(kuò)環(huán)反應(yīng)。之后Chin等對(duì)體外反應(yīng)體系進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)一步擴(kuò)大了scDAOCS催化擴(kuò)環(huán)反應(yīng)的底物范圍[6]。

然而DAOCS對(duì)其非天然底物青霉素G的活性較低，為了利用青霉素G來(lái)合成頭孢菌素類抗生素的前體化合物7-苯乙酰胺基-3-脫乙酰氧頭孢烷酸 (G-7-ADCA)，需要對(duì)DAOCS進(jìn)行改造。對(duì)DAOCS進(jìn)行活性改造的依據(jù)主要是基于定向進(jìn)化、多重序列比對(duì)以及由晶體結(jié)構(gòu)[7]推測(cè)出來(lái)的活性中心的分析。通過(guò)易錯(cuò)PCR[8-9]、DNA shuffling[9-10]、定點(diǎn)突變[6,8,11-13]、飽和突 變[14-15]、雙突變[16]及組合突變[17]等，目前已經(jīng)獲得大量scDAOCS突變體，對(duì)青霉素G的催化活力有明顯提高[18]。最近，本實(shí)驗(yàn)室季俊杰等通過(guò)組合已知的有利突變，獲得一系列對(duì)青霉素G活力提高的scDAOCS突變體，其中H5、H6與H7的catm分別提高至野生型的48、53與81倍[17]。

圖1 DAOCS催化的擴(kuò)環(huán)反應(yīng)[17]

在對(duì)scDAOCS催化擴(kuò)環(huán)反應(yīng)的機(jī)理探索和活性改造過(guò)程中，人們已經(jīng)注意到青霉素G對(duì)scDAOCS的催化活性有抑制作用。Valeg?rd等在對(duì)scDAOCS反應(yīng)機(jī)理的探索過(guò)程中曾經(jīng)考察過(guò)青霉素G以及α-酮戊二酸濃度對(duì)于反應(yīng)穩(wěn)態(tài)速率的影響，他們通過(guò)固定青霉素G和α-酮戊二酸中一個(gè)的濃度，變化另一個(gè)的濃度，發(fā)現(xiàn)青霉素G或者α-酮戊二酸濃度的升高均會(huì)對(duì)穩(wěn)態(tài)反應(yīng)速率產(chǎn)生抑制作用[7]。Wei等在對(duì)scDAOCS進(jìn)行活性改造的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，大部分多位點(diǎn)突變體在青霉素濃度為10 mmol/L時(shí)表現(xiàn)出明顯的底物抑制現(xiàn)象[8]。Hsu等利用DNA shuffling對(duì)scDAOCS進(jìn)行改造的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)進(jìn)化得到的高活性突變體都表現(xiàn)出顯著的底物抑制現(xiàn)象[10]，但是他們也發(fā)現(xiàn)有一些活性很好的突變體在青霉素G濃度為10 mmol/L時(shí)并不存在底物抑制，活性的高低似乎與底物抑制的產(chǎn)生之間并沒(méi)有必然聯(lián)系。

在對(duì)scDAOCS與Fe2+、α-酮戊二酸和/或青霉素G的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，Valeg?rd等推斷DAOCS催化擴(kuò)環(huán)反應(yīng)的機(jī)理可能為“乒乓機(jī)制”[7]。晶體結(jié)構(gòu)顯示青霉素G與scDAOCS存在兩種結(jié)合方式，其中一種為非生產(chǎn)構(gòu)象，不能發(fā)生擴(kuò)環(huán)反應(yīng)。另外青霉素G與α-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)有部分重疊，因此作者推測(cè)二者不能同時(shí)結(jié)合，進(jìn)而提出一種兩階段的反應(yīng)機(jī)理[7]。在scDAOCS的活性中心，F(xiàn)e2+與His183、Asp185、His243及三分子H2O形成八面體配位結(jié)構(gòu)；α-酮戊二酸和O2先后與scDAOCS結(jié)合，取代活性中心的H2O并與Fe(II) 結(jié)合，發(fā)生脫羧與氧化反應(yīng)，再經(jīng)重排形成活潑的高氧化態(tài)Fe(IV) 形式；待生成的琥珀酸解離之后，青霉素底物再與scDAOCS結(jié)合并被Fe(IV) 氧化發(fā)生擴(kuò)環(huán)反應(yīng)。按照這一反應(yīng)機(jī)理，青霉素G如果以非生產(chǎn)構(gòu)象結(jié)合，將阻礙α-酮戊二酸與scDAOCS結(jié)合，從而表現(xiàn)為典型的競(jìng)爭(zhēng)性抑制機(jī)制。然而Tarhonskaya等最近對(duì)scDAOCS的前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)與底物結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究[19]卻對(duì)這一機(jī)制提出了質(zhì)疑。根據(jù)他們的研究，scDAOCS更有可能采取的是非血紅素Fe2+和α-酮戊二酸依賴的氧化酶家族保守的雙底物有序結(jié)合催化機(jī)制：α-酮戊二酸與青霉素按順序與scDAOCS結(jié)合，形成DAOCS·Fe2+·α-酮戊二酸·青霉素四元復(fù)合物，隨后O2與該復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致α-酮戊二酸氧化脫羧，產(chǎn)生Fe(IV)-O過(guò)渡態(tài)，使得青霉素甲基去氫并發(fā)生重排，完成擴(kuò)環(huán)反應(yīng)。按照這一反應(yīng)機(jī)制，青霉素G的底物抑制效應(yīng)可能存在其他作用機(jī)理。

到目前為止，對(duì)DAOCS反應(yīng)特性的研究及蛋白質(zhì)工程改造的評(píng)價(jià)都極少涉及到高濃度底物，一般是在10 mmol/L或更低底物濃度下進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)，而高濃度底物下DAOCS的催化活性表現(xiàn)，對(duì)于工業(yè)應(yīng)用具有極其重要的參考價(jià)值。本文通過(guò)對(duì)scDAOCS野生型和本實(shí)驗(yàn)室季俊杰等構(gòu)建的幾個(gè)高活性組合突變體H4、H5、H6、H7[17]在5.6–500 mmol/L青霉素G濃度區(qū)間內(nèi)的催化活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中突變體H6在此范圍內(nèi)催化活性最高，并發(fā)現(xiàn)青霉素G對(duì)野生型scDAOCS的抑制作用與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型預(yù)測(cè)一致，這一結(jié)果對(duì)DAOCS高活力突變體在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

青霉素G、維生素C、MOPS等購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，α-酮戊二酸、二硫代蘇糖醇 (DTT) 購(gòu)自Merck公司，F(xiàn)eSO4購(gòu)自天津市天河化學(xué)試劑廠，KH2PO4購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，色譜純乙腈購(gòu)自Duksan Pure Chemicals公司，G-7-ADCA由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所徐冠珠提供，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

HPLC儀：島津Prominence色譜系統(tǒng)，配備SPD-20A雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、LC-20AT低壓四元泵及混合器、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱 (3.5mm，4.6 mm′150 mm)。

LC-MS儀：安捷倫1200型HPLC系統(tǒng)，6460型三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)。

1.1.3 菌株與質(zhì)粒

質(zhì)粒pET-SC (pET30a(+)::，卡那霉素抗性，scDAOCS的表達(dá)載體) 由本實(shí)驗(yàn)室的伍曉斌博士構(gòu)建[12]、大腸桿菌JM109和BL21 (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存，scDAOCS突變體H4、H5、H6和H7由本實(shí)驗(yàn)室季俊杰等構(gòu)建[17]。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0。121 ℃滅菌30 min，加入15 g/L瓊脂即為固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中使用抗生素時(shí)，加入卡那霉素終濃度為50 mg/L。

1.1.5 緩沖液

含有5%甘油的緩沖液 M (g/L)：MOPS 11.626 1，DTT 0.171 4，pH 7.5。注意要現(xiàn)配現(xiàn)用，防止DTT氧化。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法與活性測(cè)定

將含有野生型和H4、H5、H6和H7突變體scDAOCS基因的BL21 (DE3) 轉(zhuǎn)化子接種到含有50 mg/L卡那霉素的10 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取出0.5 mL按照1%接種量接種到50 mL的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)至600=0.4，隨后加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，在25 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。發(fā)酵完成后三角瓶取出冰浴， 9 000 r/min、4 ℃條件下離心3 min收集菌體。然后用含有5%甘油的緩沖液 M (pH 7.5) 沖洗菌體3遍，再將沖洗后的菌體重懸于10 mL的上述緩沖液中，超聲破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心15 min取上清，即為粗酶液。由于scDAOCS在空氣中很快失活，因此活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)使用粗酶液進(jìn)行。粗酶液總蛋白測(cè)定采用Bradford 法[20]。粗酶液中scDAOCS的含量通過(guò)對(duì)粗酶液SDS-PAGE圖像利用ImageJ軟件[21]進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)與計(jì)算得到。scDAOCS的1個(gè)酶活性單位定義為每分鐘形成1 μg G-7-ADCA所需要的DAOCS的質(zhì)量，DAOCS野生型酶及各突變體的比活力定義為每1 mg scDAOCS中含有的酶活性單位數(shù)[17]。

1.2.2 建立G-7-ADCA與青霉素G的HPLC定量檢測(cè)方法

所用HPLC分析條件為：

流動(dòng)相：A：10 mmol/L KH2PO4，用濃磷酸調(diào)至pH 3.0。B：含有0.1%三氟乙酸的乙腈。

洗脫條件：流速0.5 mL/min，70%A/30%B等度洗脫，洗脫時(shí)間25 min。采用220和260 nm進(jìn)行HPLC分析檢測(cè)[21]。

青霉素G定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別配制0.5、1、2、4、6及8 mmol/L的青霉素G水溶液，各取10 μL上樣進(jìn)行HPLC分析。以青霉素G濃度為橫軸，220 nm下吸收峰面積為縱軸，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

G-7-ADCA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：分別配制0.016、0.032、0.040、0.064、0.080及0.128 mmol/L的G-7-ADCA水溶液，各取10 μL上樣進(jìn)行HPLC分析。以G-7-ADCA濃度為橫軸，260 nm下吸收峰面積為縱軸，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 蛋白反應(yīng)活性測(cè)定

取220 μL粗酶液，按順序加入FeSO4、α-酮戊二酸、維生素C儲(chǔ)液各10mL (終濃度分別為FeSO41.8 mmol/L，α-酮戊二酸4.0 mmol/L，維生素C 0.4 mmol/L)，250 μL不同濃度青霉素G儲(chǔ)液 (終濃度分別為：5.6、10、20、40、80、100、200、300、500 mmol/L)，30℃、220 r/min反應(yīng)30 min[5]。100℃金屬浴終止反應(yīng)， 13 000 r/min離心5 min，取上清10 μL進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定260 nm下G-7-ADCA吸收峰面積，計(jì)算G-7-ADCA產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 scDAOCS各突變體的活性

在Wei等[9]報(bào)道的scDAOCS高活力突變體H4 (C155Y/Y184H/V275I/C281Y) 基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室季俊杰等采用迭代組合突變策略，引入已知的有利突變，構(gòu)建了高活力突變體H5 (H4+I305M)、H6 (H5+T213V) 及H7 (H6+M73T)，并在低青霉素G濃度下 (0.2–10.0 mmol/L) 對(duì)其活性進(jìn)行了評(píng) 價(jià)[17]。為了在更接近工業(yè)應(yīng)用條件下評(píng)價(jià)這些高活力scDAOCS，我們?cè)?.6–500 mmol/L青霉素G濃度下對(duì)其催化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

HPLC分析scDAOCS催化反應(yīng)混合物的結(jié)果如圖2所示，G-7-ADCA在220與260 nm下均有較強(qiáng)吸收，保留時(shí)間約為14 min；青霉素G僅在220 nm下具有較強(qiáng)吸收，保留時(shí)間約為18.5 min。

圖2 青霉素G (A)、G-7-ADCA標(biāo)準(zhǔn)樣 (B)及反應(yīng)混合物的HPLC譜圖 (C)

為進(jìn)一步驗(yàn)證反應(yīng)產(chǎn)物，我們收集對(duì)應(yīng)于G-7-ADCA標(biāo)準(zhǔn)樣的HPLC峰并進(jìn)行LC-MS檢驗(yàn) (負(fù)離子模式)。結(jié)果如圖3所示，可見(jiàn)預(yù)期的分子離子峰及相關(guān)信號(hào)：/331.1 ([M-H]–)，663.2 ([2M-H]–)，287.1 ([M-COOH]–)。這一結(jié)果表明該產(chǎn)物的確是預(yù)期產(chǎn)物G-7-ADCA。

野生型scDAOCS以及突變體H4、H5、H6和H7在5.6–500 mmol/L青霉素G范圍內(nèi)的比活力結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明野生型scDAOCS以及這些突變體隨青霉素G濃度的增加均出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，但其表現(xiàn)形式卻有明顯差別。

對(duì)于野生型scDAOCS和突變體H4來(lái)說(shuō)，其催化活性在青霉素G濃度約200 mmol/L時(shí)最強(qiáng)，青霉素G濃度繼續(xù)增加時(shí)，其活性明顯下降。這種先升后降的趨勢(shì)與經(jīng)典的競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型并不吻合。經(jīng)典的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑不改變表觀max，只是使表觀m增大，因此在底物濃度增加時(shí)催化反應(yīng)速率仍能不斷增加，并趨近于無(wú)抑制劑存在時(shí)的max。因此這一結(jié)果表明，Valeg?rd等推斷的競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型并不正確。另外，在青霉素G濃度大于40 mmol/L時(shí)野生型酶與H4的活性基本一致，說(shuō)明H4在高青霉素G濃度下的表現(xiàn)并不好。

圖3 產(chǎn)物G-7-ADCA的MS譜圖(負(fù)離子模式)

圖4 不同青霉素G濃度下scDAOCS各突變體的比活力

對(duì)于突變體H5、H6與H7來(lái)說(shuō)，它們的活性隨青霉素G濃度變化都表現(xiàn)出了奇異的先降后升再降的變化趨勢(shì)，且活性的極小值均出現(xiàn)在青霉素G濃度為80 mmol/L時(shí)；H6和H7活性的極大值出現(xiàn)在青霉素G濃度為300 mmol/L時(shí)，H5活性極大值出現(xiàn)在青霉素G濃度為200 mmol/L時(shí)。這種復(fù)雜的變化趨勢(shì)，表明在高濃度下青霉素G與scDAOCS突變體可能具有多種不同的結(jié)合方式，因而表現(xiàn)為多層次的抑制效應(yīng)。

總體看來(lái)，H6、H7兩個(gè)突變體具有更高的底物耐受性，并且H6在此濃度范圍內(nèi)的比活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他突變體，盡管在低濃度下評(píng)價(jià)其活性略低于H7[17]。這一結(jié)果表明，H6更適合用于高青霉素G濃度條件下的工業(yè)應(yīng)用中，其可以容忍底物青霉素G濃度增加到 300 mmol/L，同時(shí)仍然保持較高活性。這也提示我們，對(duì)于篩選適合工業(yè)應(yīng)用的高活力突變體來(lái)說(shuō)，在高濃度底物條件下進(jìn)行篩選是必不可少的，僅依靠低濃度底物條件下的篩選結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)可能還不夠充分。

最近，付金衡等利用突變體H7成功構(gòu)建了大腸桿菌全細(xì)胞催化青霉素G生產(chǎn)G-7-ADCA的工藝[22]。在對(duì)其進(jìn)行條件優(yōu)化時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)在青霉素G濃度達(dá)到50 mmol/L時(shí)，增加底物的促進(jìn)作用與抑制作用達(dá)到平衡，繼續(xù)增加青霉素G其產(chǎn)量不升反降[22]。這說(shuō)明青霉素G對(duì)scDAOCS的抑制作用已經(jīng)限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，換用在高濃度底物條件下仍有較強(qiáng)活力的突變體，如H6等，可能有助于進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)化能力。

2.2 青霉素G對(duì)DAOCS抑制反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型的理論預(yù)測(cè)與檢驗(yàn)

Tarhonskaya等最近對(duì)scDAOCS的前穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)與底物結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究[19]表明scDAOCS的反應(yīng)機(jī)制符合雙底物有序反應(yīng)模型，晶體結(jié)構(gòu)顯示青霉素G與scDAOCS存在兩種結(jié)合方式，其中一種結(jié)合方式與產(chǎn)物取向一致，被認(rèn)為是生產(chǎn)構(gòu)象，另一種取向與α-酮戊二酸一致，可能起抑制作用，稱為非生產(chǎn)構(gòu)象[7]。在此基礎(chǔ)上，我們提出幾種青霉素G對(duì)scDAOCS的抑制作用機(jī)理模型，并利用我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行初步的檢驗(yàn)。

我們假設(shè)scDAOCS·Fe2+·α-酮戊二酸·青霉素G四元復(fù)合物催化擴(kuò)環(huán)反應(yīng)為限速步驟，而在此之前的各個(gè)底物的結(jié)合反應(yīng)均已達(dá)到平衡，即符合穩(wěn)態(tài)平衡假設(shè)。由于在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，G-7-ADCA的產(chǎn)量較低，實(shí)際轉(zhuǎn)化率均小于5%，因此我們可以假設(shè)α-酮戊二酸與青霉素G的濃度變化不大，并以其初始濃度來(lái)近似。

模型1：假設(shè)青霉素G可以非生產(chǎn)構(gòu)象與scDAOCS結(jié)合，同時(shí)抑制了a-酮戊二酸的結(jié)合以及青霉素G以生產(chǎn)構(gòu)象結(jié)合，即Valeg?rd等[7]推測(cè)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型。其中E表示scDAOCS，OG表示a-酮戊二酸，PG表示以生產(chǎn)構(gòu)象結(jié)合的青霉素G，PGi表示以非生產(chǎn)構(gòu)象結(jié)合的青霉素G。

可推出反應(yīng)速率為

其中=p12EOG，=1+1OG，=3+12OG，E為酶濃度，OG為a-酮戊二酸濃度，PG為青霉素G濃度，p為復(fù)合物催化開(kāi)環(huán)反應(yīng)的反應(yīng)速率常數(shù)，其他參數(shù)為各步結(jié)合反應(yīng)的平衡常數(shù) (模型1)。按此速率方程，反應(yīng)速率隨青霉素G濃度增加而增加，但增加幅度逐漸放緩，呈雙曲線形。這與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果均不一致，表明青霉素G對(duì)scDAOCS的抑制不符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型。

模型2：假設(shè)青霉素G可以非生產(chǎn)構(gòu)象與scDAOCS結(jié)合，抑制了a-酮戊二酸的結(jié)合，同時(shí)不影響青霉素G以生產(chǎn)構(gòu)象結(jié)合，但無(wú)反應(yīng)活性，即對(duì)a-酮戊二酸為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，對(duì)青霉素G為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

可推出反應(yīng)速率為

其中=p12EOG，=1+1OG，=3+12OG，=36，其他參數(shù)含義同上。對(duì)其求一階導(dǎo)數(shù)可知在PG逐漸增加至?xí)r，反應(yīng)速率達(dá)到最大值，然后又隨PG增加而逐漸下降，呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，這與我們實(shí)驗(yàn)得到的scDAOCS野生型酶及突變體H4的結(jié)果一致。

模型3：假設(shè)青霉素G可以非生產(chǎn)構(gòu)象與scDAOCS結(jié)合，同時(shí)不影響a-酮戊二酸結(jié)合以及青霉素G以生產(chǎn)構(gòu)象結(jié)合，但無(wú)反應(yīng)活性，即對(duì)a-酮戊二酸和青霉素G均為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

可推出反應(yīng)速率為

其中=p12EOG，=1+1OG，=3+12OG+14OG，=125OG，其他參數(shù)含義同上。因?yàn)榉磻?yīng)速率的形式與模型2一致，因此其表現(xiàn)也應(yīng)相同。

綜上所述，根據(jù)理論模型與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較，可以推論：青霉素G在scDAOCS上至少有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并且可以同時(shí)結(jié)合，即青霉素G對(duì)其自身為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。但是從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能判斷青霉素G對(duì)a-酮戊二酸為競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

盡管理論模型對(duì)反應(yīng)速率變化趨勢(shì)的推論與scDAOCS野生型酶及突變體H4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，但是仍不能解釋H5、H6及H7的復(fù)雜變化趨勢(shì)。相對(duì)于H4，這3個(gè)突變體都多出一個(gè)共同的突變位點(diǎn)I305M[17]。Wei等的研究結(jié)果表明I305位點(diǎn)的突變對(duì)scDAOCS活性有重要影響，對(duì)于青霉素G，I305M是I305突變體中cat增加最大的[8]。晶體結(jié)構(gòu) (PDB：1UOB[7]) 顯示I305位于活性中心，側(cè)鏈末端距離Fe(II) 約4 ?。I305可直接參與底物青霉素的結(jié)合，其側(cè)鏈末端與青霉素的四元內(nèi)酰胺環(huán)接近，與1位硫原子及5、6位碳原子距離在5 ?以內(nèi)，形成疏水作用；與α-酮戊二酸距離也在4?6 ?，但未形成有利的相互作用。將此位點(diǎn)突變?yōu)镸et，盡管突變后Met仍以疏水作用為主，但是其側(cè)鏈更長(zhǎng)，同時(shí)引入一個(gè)硫原子，因此該突變可能改變了底物結(jié)合口袋的形狀及化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而使底物青霉素G及α-酮戊二酸的結(jié)合方式與結(jié)合能力發(fā)生變化，從而引起復(fù)雜的底物抑制現(xiàn)象。對(duì)突變體I305M及其與青霉素G和α-酮戊二酸的復(fù)合物進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)研究，可能有助于我們了解其可能的作用機(jī)制。

3 結(jié)論

青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶是酶法催化青霉素類化合物合成頭孢類化合物的關(guān)鍵酶，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。我們研究了scDAOCS野生型酶以及高活力突變體H4、H5、H6、H7在青霉素G濃度5.6–500 mmol/L區(qū)間內(nèi)的活性變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)在高青霉素G濃度下它們均存在明顯的底物抑制現(xiàn)象，其中H6在青霉素G濃度大于 100 mmol/L時(shí)仍能保持較高的催化活力，適合在高濃度底物下的工業(yè)應(yīng)用。

野生型scDAOCS及各個(gè)突變體在高青霉素G濃度 (大于80 mmol/L) 均表現(xiàn)出復(fù)雜的底物抑制現(xiàn)象，其中野生型酶及突變體H4的表現(xiàn)與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制模型預(yù)測(cè)相符，而突變體H5、H6和H7可能有更復(fù)雜的抑制作用機(jī)制。

[1] Baldwin JE, Abraham E. The biosynthesis of penicillins and cephalosporins. Nat Prod Rep, 1988, 5(2): 129–145.

[2] Valeg?rd K, van Scheltinga AC, Lloyd MD, et al. Structure of a cephalosporin synthase. Nature, 1998, 394(6695): 805–809.

[3] Kovacevic S, Weigel BJ, Tobin MB, et al. Cloning, characterization, and expression inof thegene encoding deacetoxycephalosporin C synthetase. J Bacteriol, 1989, 171(2): 754–760.

[4] Diez B, Mellado E, Rodriguez M, et al. Recombinant microorganisms for industrial production of antibiotics. Biotechnol Bioeng, 1997, 55(1): 216–226.

[5] Cho H, Adrio JL, Luengo JM, et al. Elucidation of conditions allowing conversion of penicillin G and other penicillins to deacetoxycephalosporins by resting cells and extracts ofNP1. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95(20): 11544–11548.

[6] Chin HS, Sim TS. C-terminus modification ofdeacetoxycephalosporin C synthase improves catalysis with an expanded substrate specificity. Biochem Biophys Res Comm, 2002, 295(1): 55–61.

[7] Valeg?rd K, van Scheltinga AC, Dubus A, et al. The structural basis of cephalosporin formation in a mononuclear ferrous enzyme. Nat Struct Mol Biol, 2004, 11(1): 95–101.

[8] Wei CL, Yang YB, Wang WC, et al. Engineeringdeacetoxycephalosporin C synthase for optimal ring expansion activity toward penicillin G. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(4): 2306–2312.

[9] Wei C, Yang Y, Deng C, et al. Directed evolution ofdeacetoxycephalosporin C synthase for enhancement of penicillin G expansion. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(12): 8873–8880.

[10] Hsu J, Yang Y, Deng C, et al. Family shuffling of expandase genes to enhance substrate specificity for penicillin G. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(10): 6257–6263.

[11] Lee HJ, Dai YF, Shiau CY, et al. The kinetic properties of various R258 mutants of deacetoxycephalosporin C synthase. Eur J Biochem, 2003, 270(6): 1301–1307.

[12] Ji J, Tian X, Fan K, et al. New strategy of site-directed mutagenesis identifies new sites to improvedeacetoxycephalosporin C synthase activity toward penicillin G. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(6): 2395–2401.

[13] Chin HS, Sim J, Sim TS. Mutation of N304 to leucine indeacetoxycephalosporin C synthase creates an enzyme with increased penicillin analogue conversion. Biochem Biophys Res Comm, 2001, 287(2): 507–513.

[14] Goo KS, Chua CS, Sim TS. A complete library of amino acid alterations at R306 indeacetoxycephalosporin C synthase demonstrates its structural role in the ring-expansion activity. Proteins, 2008, 70(3): 739–47.

[15] Chin HS, Goo KS, Sim TS. A complete library of amino acid alterations at N304 indeacetoxycephalosporin C synthase elucidates the basis for enhanced penicillin analogue conversion. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(1): 607–609.

[16] Goo KS, Chua CS, Sim TS. Relevant double mutations in bioengineereddeacetoxycephalosporin C synthase result in higher binding specificities which improve penicillin bioconversion. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(4): 1167–1175.

[17] Ji J, Fan K, Tian X, et al. Iterative combinatorial mutagenesis as an effective strategy for generation of deacetoxycephalosporin C synthase with improved activity toward penicillin G. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(21): 7809–7812.

[18] Goo KS, Chua CS, Sim TS. Directed evolution and rational approaches to improvingdeacetoxycephalosporin C synthase for cephalosporin production. J Ind Microbiol Biotechnol, 2009, 36(5): 619–633.

[19] Tarhonskaya H, Sz?ll?ssi A, Leung IKH, et al. Studies on deacetoxycephalosporin C synthase support a consensus mechanism for 2-oxoglutarate dependent oxygenases. Biochemistry, 2014, 53(15): 2483–2493.

[20] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Chem, 1976, 72(1/2): 248–254.

[21] Girish V, Vijayalakshmi A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer, 2004, 41(1): 47–47.

[22] Fu JH, Zhao J, Lin BX, et al. Optimization of whole-cell biocatalysis for phenylacetyl-7- aminodeacetoxycephalosporanic acid production. Chin J Biotech, 2014, 30(11): 1782–1786(in Chinese).付金衡, 趙健, 林白雪, 等. 全細(xì)胞催化生產(chǎn)苯乙酰-7-氨基-3-脫乙酰氧基頭孢烷酸的條件優(yōu)化. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(11): 1782–1786.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Evaluation of penicillin expandase mutants and complex substrate inhibition characteristics at high concentrations of penicillin G

Linjun Wu1,2, Keqiang Fan1, Junjie Ji1, and Keqian Yang1

1 State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Penicillin expandase, also known as deacetoxycephalosporin C synthase (DAOCS), is an essential enzyme involved in cephalosporin C biosynthesis. To evaluate the catalytic behaviors of penicillin expandase under high penicillin G concentration and to identify mutants suitable for industrial applications, the specific activities of wild-type DAOCS and several mutants with increased activities toward penicillin G were determined by HPLC under high penicillin G concentrations. Their specific activity profiles were compared with theoretical predictions by different catalytic dynamics models. We evaluated the specific activities of wild-type DAOCS and previous reported high-activity mutants H4, H5, H6 and H7 at concentrations ranging from 5.6 to 500 mmol/L penicillin G. The specific activities of wild-type DAOCS and mutant H4 increased as penicillin G concentration increased, but decreased when concentrations of substrate go above 200 mmol/L. Other mutants H5, H6 and H7 showed more complex behaviors under high concentration of penicillin G. Among all tested enzymes, mutant H6 showed the highest activity when concentration of penicillin G is above 100 mmol/L. Our results revealed that the substrate inhibition to wild-type DAOCS by penicillin G is noncompetitive. Other DAOCS mutants showed more complex trends in their specific activities at high concentration of penicillin G (>100 mmol/L), indicating more complex substrate inhibition mechanism might exist. The substrate inhibition and activity of DAOCS mutants at high penicillin G concentration provide important insight to help select proper mutants for industrial application.

deacetoxycephalosporin C synthase, substrate inhibition, high penicillin G concentration

January 29, 2015; Accepted:March 13, 2015

Keqian Yang. Tel/Fax: +86-10-64807459; E-mail: yangkq@im.ac.cn

10.13345/j.cjb.150057

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2013CB734001).

2015-05-14

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150514.1403.002.html

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2013CB734001) 資助。