陳飛，胡美榮，江賢章，陶勇，黃建忠

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共表達分子伴侶PDI和Ero1對灰蓋鬼傘過氧化物酶在畢赤酵母中表達的影響

陳飛1，胡美榮2，江賢章1，陶勇2，黃建忠1

1 福建師范大學(xué)生命科學(xué)院，福建福州 350108 2 中國科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

陳飛, 胡美榮, 江賢章, 等. 共表達分子伴侶PDI和Ero1對灰蓋鬼傘過氧化物酶在畢赤酵母中表達的影響. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(12): 1682–1689.Chen F, Hu MR, Jiang XZ, et al. Enhancement of Coprinus cinereus peroxidase in Pichia pastoris by co-expression chaperone PDI and Ero1. Chin J Biotech, 2015, 31(12): 1682–1689.

來源于灰蓋鬼傘長度為1 092 bp的CiP目的基因與AOX1啟動子一起整合進酵母染色體基因組中。重組蛋白CiP在釀酒酵母信號肽的引導(dǎo)下成功分泌到胞外，質(zhì)譜鑒定為目的蛋白，成功在畢赤酵母中表達灰蓋鬼傘過氧化物酶(CiP)。將伴侶蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶1 (Ero1)、二硫鍵異構(gòu)酶(PDI) 分別單獨及同時轉(zhuǎn)入CiP酵母受體菌中，研究它們對CiP在畢赤酵母中表達的影響。結(jié)果表明：在搖瓶中，相對于無分子伴侶的菌株，單獨整合PDI及同時整合Ero1、PDI菌株的CiP酶活分別提高了2.43 和2.62倍，活力達到316 U/mL和340 U/mL。挑選同時整合Ero1、PDI伴侶蛋白的CiP菌株，5 L發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵，酶活最高達到 3 379 U/mL，比搖瓶提高約10倍。本實驗結(jié)果較目前已報道的1 200 U/mL已是最高水平。

畢赤酵母，灰蓋鬼傘過氧化物酶，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶，二硫鍵異構(gòu)酶

過氧化物酶是一系列能夠氧化芳香胺類、酚類等化合物的氧化劑。大多數(shù)的過氧化物酶活性中心常含有伴隨三價鐵的原卟啉，且廣泛存在于生物有機體中。過氧化物酶分為哺乳類和植物類兩個超家族，根據(jù)序列比對，植物類超家族成員又被分為3種類型：一類是胞內(nèi)過氧化物酶，如酵母細胞色素C過氧化物酶；二類和三類分別為真菌胞內(nèi)過氧化物酶和植物胞內(nèi)過氧化物酶。二類過氧化物酶是二聚體糖蛋白，含有2個鈣離子和4個保守的二硫鍵，且二硫鍵形成的位置不同于三類酶[1-2]。

過氧化物酶在臨床檢驗和廢水處理方面的作用已經(jīng)引起工業(yè)化生產(chǎn)的注意[3-5]。已經(jīng)有來自于不同物種的過氧化物酶用于處理酚類聚合物[6-9]。辣根過氧化物酶屬于第三類過氧化物，由于其高效的催化活力和專一性電子供體而被人們廣泛熟知。然而，近些年被人們廣泛關(guān)注的灰蓋鬼傘過氧化物酶 (CiP) 是一種由擔(dān)子菌類分泌的二類過氧化物酶，具有與辣根過氧化物酶 (HRP) 相似的功能[10-11]。另外，CiP由單一的酶組成，而HRP由至少12種不同催化活性的酶組成，且酶的比例隨不同的生長周期進行改變。對于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)過氧化物酶來說，一個高效且經(jīng)濟的生產(chǎn)系統(tǒng)是迫切需要的。已知的釀酒酵母[12]、米曲霉[13]等已被工業(yè)化用來外源表達CiP。2009年Kim等在畢赤酵母中功能表達了CiP，以ABTS為底物，其m和m分別為22.4 μmol/L、1.82 μmol/(L·s)，在5 L發(fā)酵罐中表達活力達到1 200 U/mL，蛋白濃度 1.7 g/L，是目前報道的最高水平[14]。

畢赤酵母表達系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展成為一個成熟的外源蛋白表達系統(tǒng)，工業(yè)上常用來大規(guī)模表達外源蛋白。畢赤酵母表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)點：遺傳改造方便，外源蛋白表達水平高，真核蛋白翻譯后修飾，便于大規(guī)模發(fā)酵，分泌的重組蛋白易于純化[15-17]。畢赤酵母表達系統(tǒng)已經(jīng)被成功地用來表達多種重組外源蛋白[18-19]。二硫鍵異構(gòu)酶 (PDI) 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶 (Ero1) 廣泛存在于真菌、植物、動物和人內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，能夠幫助蛋白分泌。PDI是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含量最豐富的蛋白之一，可以催化3種反應(yīng)：氧化 (催化蛋白形成新的二硫鍵)；還原 (除去二硫鍵)；異構(gòu)化 (通過巰基-二硫鍵交換改變已存在的Cys配對)[20]。在酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大部分以氧化狀態(tài)存在，意味著PDI主要顯示氧化活性幫助蛋白形成正確的折疊結(jié)構(gòu)而分泌到胞外。Ero1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中氧化還原態(tài)的PDI成氧化態(tài)，間接幫助蛋白分泌[21]。缺失Ero1的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不能氧化新合成的蛋白，而缺少PDI的細胞不能存活。Zhang等[22]在畢赤酵母中通過共表達PDI使葡萄糖苷酶比活提高1.5倍；Wu等[23]在畢赤酵母中通過共表達PDI和Ero1使人血清白蛋白和人生長激素的融合蛋白在5 L發(fā)酵罐上表達量提高到3?4 g/L。

本實驗中，我們首先在畢赤酵母中成功表達并分泌CiP，然后通過整合分子伴侶蛋白PDI和Ero1，進一步提高CiP的表達。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸克隆菌株 T1購自全式金公司；酵母表達菌株X33、穿梭質(zhì)粒pPIC9k、pPICZαA購自Invitrogen公司；目的基因CiP由南京金斯瑞合成。GenBank登錄號為XM_001834316，去掉信號肽 (前20個氨基酸)。

1.2 主要試劑和儀器

Q5 DNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶BⅠ、RⅠ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ、HⅠ購自NEB公司；核酸marker購自奧賽博公司；蛋白marker和T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；ABTS[2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiaoline-6-sulp-honate)]購自Sigma公司；博來霉素 (Zeocin)、G418購自Invitorgen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自O(shè)mega公司；PCR儀購自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；核酸電泳儀購自Bio-Rad公司；蛋白電泳儀購自君意公司；凝膠成像儀購自天能公司；引物由北京生工合成；DNA測序由北京博尚公司完成。

1.3 方法

常規(guī)分子生物學(xué)操作參照《分子克隆手冊》[24]進行。

1.3.1 融合表達載體的構(gòu)建

CiP全基因合成序列，兩端分別是RⅠ和Ⅰ酶切位點，雙酶切純化后與同樣雙酶切的pPIC9k載體連接，構(gòu)建克隆載體pPIC9k-CIP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行PCR鑒定和酶切鑒定，基因測序正確后獲得構(gòu)建成功的融合表達載體。

根據(jù)伴侶蛋白Ero1和PDI基因序列設(shè)計寡核苷酸鏈，合成引物 (表1)，通過PCR技術(shù)利用引物P1和P2、P3和P4分別以畢赤酵母的基因組為模板擴增出Ero1和PDI基因序列，兩端均分別含有BⅠ和Ⅰ酶切位點。雙酶切純化后將Ero1和PDI的成熟片段與分別同樣雙酶切的pPICZ載體連接，構(gòu)建克隆載體pPICZ-ERO1和pPICZ-PDI。轉(zhuǎn)化T1感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行PCR、酶切鑒定和基因測序，獲得正確的融合載體。將基因測序正確的重組質(zhì)粒pPICZ-PDI利用引物P5和P6擴增出含有AOX啟動子、PDI基因以及終止子區(qū)域的目的片段，與測序正確且HⅠ線性化的重組質(zhì)粒pPICZ-ERO1進行同源重組，采用NOVO protein同源重組方法，構(gòu)建克隆載體pPICZ-ERO1-PDI。轉(zhuǎn)化T1感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行PCR鑒定、酶切鑒定、基因測序，獲得構(gòu)建成功的載體。

表1 分子伴侶基因PCR擴增引物列表

1.3.2 陽性轉(zhuǎn)化子的獲得

將測序正確的重組質(zhì)粒pPIC9k-CIP進行Ⅰ線性化后電轉(zhuǎn)表達宿主畢赤酵母，構(gòu)建重組菌X33/pPIC9k-CIP，涂布在終濃度為250 μg/mL G418的YPD平板上，3 d后獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

將3個測序正確的重組質(zhì)粒pPICZ-ERO1、pPICZ-PDI、pPICZ-ERO1-PDI進行Ⅰ線性化后分別電轉(zhuǎn)同一株含有CiP的表達宿主，構(gòu)建分別含有分子伴侶Ero1、PDI、Ero1-PDI的CiP菌株X33/pPICZ- ERO1、X33/pPICZ-PDI、X33/pPICZ-ERO1-PDI，涂布在終濃度250 μg/mL G418和50 μg/mL博萊霉素的YPD雙抗平板上，3 d后獲得陽性轉(zhuǎn) 化子。

1.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達和SDS-PAGE檢測

將重組菌株X33/pPIC9k-CIP和分別整合分子伴侶Ero1、PDI、Ero1-PDI的X33/pPIC9k-CIP菌株進行YPD (1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉) 平板劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于3 mL YPCS (1%酵母浸出物，2%蛋白胨，0.5%酪蛋白水解物，0.5%山梨醇) 試管種子培養(yǎng)基中，24 h后1%接種量轉(zhuǎn)接到250 mL 裝液量50 mL的YPCS搖瓶中，24 h后加1% (/) 甲醇和終濃度為50 μmol/L的血紅素，48 h和72 h后均各加1% (/) 甲醇誘導(dǎo)，96 h收菌， 8 000 r/min離心5 min收集上清，上清進行SDS-PAGE檢測。

1.3.4 CiP酶活測定

用ABTS和雙氧水進行酶活測定[14]：取 1 μL稀釋的上清酶液至0.3 mL ABTS-H2O2(2 mmol/L ABTS，2.9 mmol/L H2O2，pH 4.4) 中，利用UV1800測定420 nm (被氧化的ABTS摩爾消光系數(shù)為3.6×104L/(mol·cm)) 下1 min內(nèi)活度值的變化△G，溫度控制在25 ℃，酶活(U/mL)=△G×0.3×稀釋倍數(shù)/0.036。

1.3.5 5 L發(fā)酵罐放大表達CiP

將同時含有分子伴侶Ero1和PDI的X33/pPIC9k-CIP菌株按3%接種量接種到3 mL YPD的一級試管種子液中，30 ℃，250 r/min，12 h后3%接種量轉(zhuǎn)接到500 mL裝液量100 mL BMGY (1%酵母浸出物，2%蛋白胨，1.34% YNB，400 μg/L生物素，1%甘油，100 mmol/L pH 6.0的磷酸鉀緩沖液) 二級種子液搖瓶中，30 ℃，250 r/min，12 h后600到10，10%的接種量接種到5 L的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐初始裝1.8 L BSM培養(yǎng)基，每升BSM含：26.7 mL 85% H3PO4，0.93 g CaSO4，18.2 g K2SO4，14.9 g MgSO4·7H2O，4.13 g KOH，40 g甘油和4.35 mL PTM1 (過濾除菌)；每升PTM1含6.0 g CuSO4·5H2O，0.08 g NaI，3.0 g MnSO4·H2O， 0.2 g NaMoO4·2H2O，0.02 g H3BO3，0.5 g CoCl2，20.0 g ZnCl2，65.0 g FeSO4·7H2O，0.2 g生物素，5 mL H2SO4。初始發(fā)酵控制溫度30 ℃，用濃氨水(28%) 控制pH為5.0，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量控制罐上溶氧在20%以上。等BSM中甘油耗盡溶氧上升后，以18.15 mL/(h·L) 的速率流加含有1.2% (/) PTM1的50% (/) 甘油，待600到150–200時停止流加甘油，饑餓培養(yǎng) 30 min–2 h，以6 g/(h·L) 的速率流加含有 1.2% (/) PTM1的100%甲醇，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量控制溶解氧在20%以上。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白表達載體的構(gòu)建和表達

將重組質(zhì)粒pPIC9k-CIP用RⅠ和Ⅰ雙酶切鑒定，得到1 000 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。DNA測序結(jié)果證明融合目的片段序列正確。重組菌X33/pPIC9k-CIP進行甲醇誘導(dǎo)表達，胞外上清進行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明在約40 kDa處有一條明顯的條帶，發(fā)酵罐放大培養(yǎng)時，50 kDa和60 kDa處也均有條帶 (圖2)。

圖1 pPIC9k-CIP質(zhì)粒圖示(A)及酶切電泳鑒定(B)

圖2 重組蛋白CiP表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.2 重組蛋白CiP的鑒定

將圖2中的3條片段采用中國科學(xué)院微生物研究所的LC-MALDI串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進行鑒定，LC-MS的數(shù)據(jù)表明，40、50和60 kDa處蛋白和XM_001834316編碼的蛋白的同源性分別為41%、40%和14%，因此斷定40、50 kDa處蛋白一定為CiP，因為具有較高的同源性；60 kDa處蛋白尚需進一步的驗證。50 kDa處蛋白推測主要是因為糖基化所致，根據(jù)糖基化軟件分析 (CBS Prediction Servers)，推測162?165位為糖基化位點NSSQ。

2.3 搖瓶水平檢測分子伴侶對CiP表達影響

將X33/pPIC9k-CIP菌株作為空白菌株，與分別整合分子伴侶Ero1、PDI、Ero1-PDI的X33/pPIC9k-CIP菌株按照上述條件進行搖瓶發(fā)酵?？瞻拙昝富?30 U/mL，整合Ero1的CiP菌株酶活為90 U/mL，整合PDI的CiP菌株酶活為316 U/mL，同時整合Ero1、PDI的CiP菌株酶活達到340 U/mL (圖3)。由圖4可知，整合Ero1菌株蛋白表達較空白少，整合PDI、Ero1-PDI菌株蛋白表達均較空白多。

2.4 5 L發(fā)酵罐表達CiP

將空白菌株X33/pPIC9k-CIP和整合伴侶蛋白Ero1-PDI的X33/pPIC9k-CIP菌株按上述條件進行5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。發(fā)酵液上清進行SDS-PAGE分析(圖5)，整合分子伴侶的菌株蛋白表達明顯好于空白菌株，酶活和比活也均有較大提高，空白菌株發(fā)酵結(jié)束酶活867 U/mL，蛋白濃度2.1 g/L，比酶活413 U/mg。整合伴侶蛋白CiP菌株發(fā)酵結(jié)束酶活達到3 379 U/mL，蛋白濃度4.4 g/L，比活768 U/mg (圖6)。

圖3 共表達分子伴侶對CiP酶活的影響

圖4 SDS-PAGE分析分子伴侶對CiP表達的影響

圖5 SDS-PAGE分析5 L發(fā)酵罐空白菌株(A) 和添加Ero1-PDI菌株CiP表達情況(B)

3 討論

畢赤酵母表達系統(tǒng)已經(jīng)是一種成熟的外源蛋白表達系統(tǒng)，由于外源蛋白翻譯速度快來不及修飾導(dǎo)致很多蛋白留在胞內(nèi)。本文通過整合伴侶蛋白希望能夠提高目的蛋白的表達：Ero1和CiP共表達時，Ero1對CiP形成二硫鍵以及正確折疊沒有幫助，因此不能夠提高CiP的表達水平，當(dāng)Ero1和CiP同時表達時Ero1會占用一定的營養(yǎng)源，從而降低了CiP的表達水平。CiP的三級結(jié)構(gòu)中含有4個二硫鍵，PDI直接有助于二硫鍵的形成，因此有助于其表達。當(dāng)Ero1、PDI以及CiP共表達時，PDI在幫助CiP形成二硫鍵時，本身被還原，Ero1可以將PDI氧化，使其重新恢復(fù)功能，從而促進CiP的表達，因此單獨共表達PDI及同時共表達Ero1和PDI時有利于CiP的表達。本實驗單獨整合PDI和Ero1-PDI使目的蛋白酶活分別提高2.43和2.62倍，說明PDI成功幫助CiP進行正確的折疊分泌提高蛋白表達，另外，同時整合兩個分子伴侶Ero1-PDI的菌株表現(xiàn)出最高的酶活。5 L發(fā)酵罐放大實驗整合Ero1-PDI菌株酶活與表達量均有明顯提高，比活768 U/mg比空白527 U/mg提高1.46倍，酶活3 379 U/mL已是目前查閱國內(nèi)外文獻中最高酶活。

本文通過整合分子伴侶促進蛋白正確折疊從而提高蛋白表達為以后蛋白純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究奠定了良好的基礎(chǔ)，對促進其他外源蛋白在畢赤酵母中的正確折疊和表達提供了新的思路和借鑒。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Enhancement ofperoxidase inby co-expression chaperone PDI and Ero1

Fei Chen1, Meirong Hu2, Xianzhang Jiang1, Yong Tao2, and Jianzhong Huang1

1 College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, Fujian, China 2 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

The 1 095 bp gene encoding peroxidase fromwas synthesized and integrated into the genome ofwith a highly inducible alcohol oxidase. The recombinant CiP (rCiP) fused with the α-mating factor per-pro leader sequence derived fromwas secreted into the culture medium and identified as the target protein by mass spectrometry, confirming that aperoxidase (CiP) was successfully expressed in. The endoplasmic reticulum oxidoreductase 1 (Ero1) and protein disulfide isomerase (PDI) were co-expressed with rCiP separately and simultaneously. Compared with the wild type, overexpression of PDI and Ero1-PDI increaseed Cip activity in 2.43 and 2.6 fold and their activity reached 316 U/mL and 340 U/mL respectively. The strains co-expressed with Ero1-PDI was used to high density fermentation, and their activity reached 3 379 U/mL, which was higher than previously reported of 1 200 U/mL.

,peroxidase, endoplasmic reticulum oxidoreductase 1, protein disulfide isomerase

January 26, 2015; Accepted: July 13, 2015

Jianzhong Huang. Tel: +86-591-22868212; E-mail: hjz@fjnu.edu.cn

10.13345/j.cjb.150051

Supported by:Key Technologies of Industrialization Project in Fujian Province (No. [2010]358).

福建省產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)項目 (No. 閩財指[2010]358號) 資助。