陳曉英，彭 齊，胡大清，何 蕾

武漢亞洲心臟病醫(yī)院心外科，武漢 430022

CYP2C9及VKORC1基因多態(tài)性對華法林穩(wěn)態(tài)劑量和模型預測劑量的相關性研究＊

陳曉英，彭 齊△，胡大清，何 蕾

武漢亞洲心臟病醫(yī)院心外科，武漢 430022

目的 研究湖北地區(qū)漢族人性別、年齡、身高、體重、細胞色素P450酶2C9基因（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1（VKORC1）基因型與華法林穩(wěn)態(tài)劑量及計算機模型預測劑量的相關性。方法 收集湖北地區(qū)漢族人群臨床使用華法林的患者，采用聚合酶鏈反應－限制性內切酶片段長度多態(tài)性（PCR－RFLP）技術檢測CYP2C9和VKORC1基因型，同時記錄患者的年齡、性別、體重、身高、國際標準化比值（INR）、華法林穩(wěn)態(tài)劑量和計算機模型預測劑量等臨床資料，并對這些臨床資料進行相關分析及多元回歸分析。結果 435例患者的CYP2C9基因型檢測顯示402例為＊1／＊1型（92.41%）、30例為＊1／＊3型（6.90%）、3例＊3／＊3型（0.69%）。前兩型患者華法林劑量分別為（2.91 ±1.12）mg／d、（1.91±0.85）mg／d，＊1／＊3型較＊1／＊1型華法林需求量少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（CYP2C9基因型＊3／＊3型樣本量太少，未參與組間比較）；VKORC1基因型檢測顯示354例為AA型（81.4%）、77例為雜合子GA型（17.7%）、4例為純合子GG型（0.9%）?；颊呷A法林劑量分別為（2.58±0.94）mg／d、（3.82±1.52）mg／d、（5.62± 1.77）mg／d，AA型較GA型華法林需求量少，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（VKORC1基因型GG型樣本量太少，未參與組間比較）。同時對患者的年齡、身高、體重、兩種基因型、穩(wěn)態(tài)劑量以及計算機模型預測劑量均分別行相關分析及多元回歸分析，提示華法林劑量與患者的年齡、身高、體重及不同的基因型均有關，且相關分析提示計算機模型預測劑量與穩(wěn)態(tài)劑量的相關系數(shù)為0.611，且有統(tǒng)計學意義；行穩(wěn)態(tài)劑量的多元回歸分析顯示CYP2C9、VKORC1基因型、年齡、體重與穩(wěn)態(tài)劑量相關，有統(tǒng)計學意義。結論 在湖北地區(qū)漢族人群中，存在CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性，且不同基因型患者間華法林用量存在差異，同時華法林劑量與年齡、體重及不同的基因型有關，計算機模型預測劑量與穩(wěn)態(tài)劑量存在相關性且有統(tǒng)計學意義。

華法林； 劑量； 基因多態(tài)性； CYP2C9； VKORC1

為防止心臟瓣膜置換手術后血栓形成或栓塞發(fā)生需口服華法林抗凝治療［12］，但口服華法林抗凝需要監(jiān)測國際標準化比值（INR），由于個體間細胞色素P450酶2C9基因（CYP2C9）和維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位1基因（VKORC1）多態(tài)性的存在［12］，使華法林劑量個體差異明顯，要達到相同的抗凝效果，劑量差別極大［2］，即使INR值在目標范圍內仍有部分患者出現(xiàn)出血并發(fā)癥。目前新型的、抗凝作用肯定、劑量固定、無需監(jiān)測凝血指標的口服抗凝劑達比加群酯在非瓣膜病心房顫動患者的抗凝治療中逐漸被認可［34］。但在心臟機械瓣膜置換術后患者中的應用尚未見研究報道，因此，目前口服華法林仍然是心臟瓣膜置換術后抗凝的標準治療。本文旨在研究湖北地區(qū)漢族人群中CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性、患者的臨床特征和不同的基因型對華法林劑量的影響及華法林穩(wěn)態(tài)劑量與模型預測劑量的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2012年3月至2013年6月在武漢亞洲心臟病醫(yī)院心外科行心臟瓣膜置換術患者435例。入選標準:湖北省內18歲以上漢族人（相互間無血緣關系及異族通婚史）、術后口服華法林抗凝、INR控制在2.0～3.0之間。剔除標準:肝、腎及甲狀腺功能異常；服用利福平及巴比妥等影響華法林藥動學效果的藥物；服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等影響INR的藥物。

1.2 研究方法

1.2.1 資料采集收集 取入選受試者的靜脈血（枸櫞酸鈉抗凝）3mL用于檢測INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同時記錄患者的年齡、性別、體重、身高、INR、華法林穩(wěn)態(tài)劑量和計算機模型預測劑量等臨床資料。

1.2.2 方法 從血液中提取患者DNA，擴增目的片段，再進行測序。DNA提取采用TIANGEN血液基因組提取試劑盒，測序儀為美國ABI 3500Genetic Analyzer。采用國際華法林藥理學聯(lián)盟（IWPC:International Warfarin Pharmacogenetics Consortium）建立的華法林劑量預測模型來預測華法林劑量，該模型是聯(lián)合9個國家的21個研究小組，收集了用華法林治療的超過4 000例患者（亞洲人種1 200余例）的臨床和遺傳學數(shù)據(jù)而建立，模型中納入了遺傳因素以及臨床因素。這個模型是目前最權威的兩個華法林劑量預測模型之一［5］。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，Pearsonχ2檢驗用于檢查基因型頻率是否符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律。分析華法林劑量與年齡、身高、體重以及INR值的關系及CYP2C9、VKORC1基因型之間華法林劑量的比較使用兩樣本t檢驗。多元線性回歸用于分析華法林劑量與各變量之間的關系。采用雙側檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同基因型患者的臨床資料及穩(wěn)態(tài)劑量的比較

435例患者的CYP2C9基因型檢測顯示402例為＊1／＊1型（92.41%）、30例為＊1／＊3型（6.90%）、3例＊3／＊3型（0.69%）?；颊呷A法林劑量分別為（2.91±1.12）mg／d、（1.91±0.85）mg／d，＊1／＊3型較＊1／＊1型華法林需求量少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表1，CYP2C9基因型＊3／＊3型樣本量太少，未參與組間比較）；VKORC1基因型檢測顯示354例為AA型（81.4%）、77例為雜合子GA型（17.7%）、4例為純合子GG型（0.9%）?；颊呷A法林劑量分別為（2.58±0.94）mg／d、（3.82± 1.52）mg／d、（5.62±1.77）mg／d，AA型較GA型華法林需求量少，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（表1，VKORC1基因型GG型樣本量太少，未參與組間比較）。

2.2 患者穩(wěn)態(tài)劑量的相關因素分析

分別對年齡、性別、身高、體重、兩種基因型與穩(wěn)態(tài)劑量進行直線相關分析，顯示華法林劑量與患者的年齡、身高、體重及VKORC1與CYP2C9基因型有關（其相關系數(shù)分別為－0.266，0.232，0.228，0.450，－0.227），且相關分析同時提示模型預測劑量與穩(wěn)態(tài)劑量的相關系數(shù)為0.611，差異有統(tǒng)計學意義；同時納入患者年齡、身高、體重、2種基因型，行穩(wěn)態(tài)劑量的多元回歸分析顯示CYP2C9、 VKORC1基因型、年齡、體重有統(tǒng)計學意義（表2）。

表1 CYP2C9與VKORC1基因型患者的臨床資料及穩(wěn)態(tài)劑量的比較（）Table1 Comparison of clinical data and stable warfarin dose between patients with different CYP2C9and VKORC1genotypes

表1 CYP2C9與VKORC1基因型患者的臨床資料及穩(wěn)態(tài)劑量的比較（）Table1 Comparison of clinical data and stable warfarin dose between patients with different CYP2C9and VKORC1genotypes

與＊1／＊1比較，△△P＜0.01；與AA比較，＃＃P＜0.01

?

表2 患者穩(wěn)態(tài)劑量多元回歸分析Table2 Multivariate regression analysis on the factors related to stable warfarin dose in patients

3 討論

口服華法林抗凝臨床適用范圍廣，目前主要用于瓣膜病合并房顫或者瓣膜置換手術后患者、深靜脈血栓形成患者、肺栓塞患者、腦梗死患者、房顫患者、心肌梗死后心尖部血栓形成患者等。但其劑量在不同種族間及個體間存在較大差異，影響華法林劑量的因素中，個體因素包括種族、遺傳、性別、年齡、身高、體重等；臨床因素主要表現(xiàn)在藥物間相互作用，例如:胺碘酮、利福平及巴比妥等藥物影響華法林藥代動力學；阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等藥物影響凝血功能［6］。其中遺傳因素可解釋約40%～74%的個體劑量差異［7］。目前研究發(fā)現(xiàn)，VKORC1和CYP2C9基因與華法林藥效學和藥代學相關。在藥效學方面，VKORC1基因啟動子區(qū)－1 639位基因G突變?yōu)锳后轉錄活性下降，其基因多態(tài)性影響華法林臨床用藥劑量；在藥代學方面，CYP2C9是CYP2C亞家族中的一種同功酶，也是許多藥物的重要代謝酶，約占肝微粒體中CYP總量的20%，其基因多態(tài)性會影響代謝酶活性，特別是存在基因突變的個體藥物不良反應的發(fā)生率更高［8－9］。

本研究探討了湖北地區(qū)漢族人群中CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性、患者的臨床特征和不同的基因型對華法林劑量的影響及華法林穩(wěn)態(tài)劑量與模型預測劑量的相關性。

本研究選取2012年3月至2013年6月在我院心外科行心臟機械瓣膜置換術的湖北地區(qū)漢族患者435例，CYP2C9基因型檢測顯示402例為＊1／＊1型、30例為＊1／＊3型、3例＊3／＊3型，以等位基因A為主，其基因型頻率分別為92.41%、6.90%、0.69%，與文獻報道的國人的基因型頻率一致［1011］。Aquilante等［12］的研究提示在西方人群中CYP2C9的等位基因同樣是以A為主（其基因型頻率為79.80%～95.30%），說明其等位基因分布未顯示存在人種差異。本研究中VKORC1基因型檢測354例為AA型、77例為雜合子GA型、4例為純合子GG型，以AA型居多，其基因型頻率分別為81.4%、17.7%、0.9%，與文獻報道的國人的基因型頻率一致［1011］。同時有文獻報道，在高加索人和非洲裔美國人中VKORC1基因以GG、GA型占大多數(shù)（GG型的基因型頻率為38.44%～79.57%，GA型的基因型頻率為19.27%～47.12%）［13］，提示在不同種族間VKORC1基因多態(tài)性分布存在人種差異。

在湖北地區(qū)漢族人群中，存在CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性，且本研究同樣提示CYP2C9和VKORC1的基因多態(tài)性是造成個體間華法林穩(wěn)態(tài)劑量差異的主要原因［1112］。具體表現(xiàn)為CYP2C9＊1／＊3型較＊1／＊1型華法林需求量少，這與突變型的CYP2C9＊1／＊3型比野生型＊1／＊1型對華法林的代謝能力下降有關［12］。VKORC1基因位于16號染色體，含3個外顯子，編碼163個氨基酸的18kD內質網(wǎng)跨膜蛋白，此蛋白質主導維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點。VKORC1基因啟動子區(qū)－1 639G＞A多態(tài)性與華法林臨床用藥劑量相關，AA基因型華法林需求較GA型和GG型低［13］。

影響華法林劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等［14］。本研究中，對患者的年齡、身高、體重、兩種基因型、穩(wěn)態(tài)劑量以及計算機模型預測劑量均分別行相關分析，結果提示華法林劑量與患者的年齡、身高、體重及不同的基因型均有關，行多元回歸分析顯示穩(wěn)態(tài)劑量與CYP2C9、VKORC1基因型、年齡、體重均有關，有統(tǒng)計學意義。本研究中性別未顯示出相關性，可能與樣本量有關，我們將在以后的研究中進一步關注此問題。

我們采用的預測模型中納入了遺傳因素以及臨床因素。其計算機模型中包含患者年齡、身高、體重、不同類型的CYP2C9和VKORC1基因型（包括未知基因型）、不同人種、酶誘導劑狀況和胺碘酮用藥狀況等因素，能夠準確地估計華法林的劑量。本研究相關分析提示此計算機模型預測劑量與實際穩(wěn)態(tài)劑量的相關系數(shù)為0.611，且有統(tǒng)計學意義，說明該模型應用于湖北地區(qū)漢族人群的華法林劑量預測是準確可行的，可以降低治療引導階段華法林過量的風險，并縮短華法林達到穩(wěn)定治療的時間。

華法林的應用范圍不只限于心臟瓣膜置換術后，在肺栓塞、持續(xù)性心房顫動及反復靜脈血栓形成、心肌梗死后心尖部血栓形成的患者中亦需要口服華法林抗凝，同時需要控制INR在目標范圍，而反復的抽血檢測及調整亦帶來諸多不便。我院目前對臨床需要口服華法林的患者進行基因型檢測，通過基因分型及計算機劑量模型預測華法林劑量，以指導臨床選擇合適的華法林劑量并盡量縮短藥物劑量的調整周期，希望能藉此減少對患者反復抽血檢測以及降低患者血栓和出血的風險。

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（2014－10－10 收稿）

Correlation of CYP2C9 and VKORC1 Polymorphisms with Warfarin Stable Dose and Computer Model－predicted Dose

Chen Xiaoying，Peng Qi△，Hu Daqing et al
Department of Cardiac Surgery，Wuhan Asia Heart Hospital，Wuhan 430022，China

Objective To investigate the association of gender，age，height，body weight，cytochrome P450 2C9（CYP2C9）and vitamin K epoxide reductase complex 1（VKORC1）genotypes with warfarin stable dose and computer model－predicted dose in Han population in Hubei province of China.Methods CYP2C9and VKORC1genotypes were determined by polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism（PCR－RFLP）technique in patients who were Han Chinese and administered with stable warfarin dose.Their clinical data including age，gender，body weight，height，international normalised ratio（INR），warfarin stable dose and computer model－predicted dose were recorded and analyzed by correlation analysis and multivariate regression analysis.Results CYP2C9genotyping showed that there were 402cases of＊1／＊1type，30of＊1／＊3type and 3of＊3／＊3type.The required warfarin dose was much lower in patients with CYP2C9＊1／＊3type than those with＊1／＊1type［（1.91±0.85）mg／d vs.（2.91±1.12）mg／d］with significant difference found（P＜0.01）.Comparison between groups didn＇t include patients with＊3／＊3type due to the limited samples.VKORC1genotyping showed that the frequencies of AA，GA，GG were 81.4%（354／435），17.7%（77／435）and 0.9%（4／435），respectively.The required warfarin dose in VKORC1 AA patients was significantly lower than that in GA patients［（2.58±0.94）mg／d vs.（3.82±1.52）mg／d］，with statistically significant difference found（P＜0.01）.VKORC1GG patients［warfarin dose:（5.62±1.77）mg／d］failed to enter the statistical analysis because of less sample size.Correlation analysis and multivariate regression analysis showed that age，body weight，CYP2C9and VKORC1genotypes were related to warfarin dose.The correlation coefficient of warfarin stable dose and predicteddose was 0.611，and these was statistically significant difference（P＜0.01）.Multivariate regression analysis showed that there was statistical association between the warfarin stable dose and CYP2C9genotype，VKORC1genotype，age or body weight.Conclusion There are CYP2C9and VKORC1polymorphisms in Han Chinese in Hubei province.There is a significant difference in daily mean warfarin dose between patients with different genotypes of CYP2C9and VKORC1.The warfarin dose is related to age，body weight，CYP2C9and VKORC1genotypes.There is a statistical correlation between warfarin stable dose and computer model－predicted dose.

warfarin； dosing regimen； gene polymorphism； CYP2C9； VKORC1

R969

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.01.018

＊武漢市衛(wèi)計委臨床醫(yī)學科研項目（No.WX13B28）

陳曉英，女，1975年生，副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，E－mail:908230364＠qq.com△

，Corresponding author，E－mail:pq＿0511＠163.com