楊 帥，周新欽，黃 寧，劉 堯，朱天鋼

（河南南陽(yáng)市匯博生物技術(shù)有限公司，河南南陽(yáng)473000）

抑菌凝膠敷料的生物學(xué)評(píng)價(jià)

楊 帥，周新欽，黃 寧，劉 堯，朱天鋼

（河南南陽(yáng)市匯博生物技術(shù)有限公司，河南南陽(yáng)473000）

目的：對(duì)抑菌凝膠敷料進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)。方法：進(jìn)行體外細(xì)胞毒試驗(yàn)以及皮膚刺激試驗(yàn)，并按照國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。結(jié)果：在顯微鏡下觀察，L929細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞相對(duì)增殖率為90.5%，細(xì)胞毒性總評(píng)級(jí)為1級(jí)，極輕細(xì)胞毒性。刺激試驗(yàn)：產(chǎn)品材料等級(jí)評(píng)分為0，無(wú)刺激反應(yīng)。

抑菌凝膠敷料；細(xì)胞毒；皮膚刺激；生物學(xué)評(píng)價(jià)

人體皮膚是與外界環(huán)境接觸的天然屏障，但由于外界疾病因素和創(chuàng)傷等造成損害時(shí)，常常會(huì)引起水分、電解質(zhì)的丟失，開(kāi)放性的創(chuàng)面往往還會(huì)引起感染［1］。在早期有效的封閉創(chuàng)面可以很好的減少細(xì)菌感染和并發(fā)癥的產(chǎn)生。抑菌凝膠敷料是南陽(yáng)市匯博生物技術(shù)有限公司研發(fā)的一款產(chǎn)品，其主要成分是羥乙基纖維素、甘油和聚六亞甲基單胍鹽酸鹽，通過(guò)浸潤(rùn)傷口覆蓋層來(lái)濕潤(rùn)傷口，用于潰瘍、燒燙傷、術(shù)后等傷口護(hù)理。為了保證該凝膠敷料應(yīng)用于人體安全無(wú)毒副作用，我們按照國(guó)家相關(guān)技術(shù)要求對(duì)該款產(chǎn)品進(jìn)行生物安全性評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒，F(xiàn)C全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo，AE2000倒置顯微鏡購(gòu)自廈門(mén)麥克奧迪，抑菌凝膠敷料（南陽(yáng)市匯博生物技術(shù)有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（以色列BI公司），胎牛血清（以色列BI公司），L929細(xì)胞（購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院），成年新西蘭兔，質(zhì)量2.0～3.0kg，由章丘市金豐肉兔養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社提供［許可證號(hào)：SCXK（魯）2014-0006］，飼養(yǎng)條件為溫度22～24℃，濕度40%～60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)：依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T16886.5進(jìn)行［2］，實(shí)驗(yàn)一共分為4組：實(shí)驗(yàn)組，材料浸提液；空白對(duì)照組，DMEM高糖培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組，高密度聚乙烯；陽(yáng)性對(duì)照組，5%的DMSO溶液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化并加入細(xì)胞培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×104個(gè)細(xì)胞／ml。試驗(yàn)步驟：將配制好的細(xì)胞懸液接種96孔培養(yǎng)板，每組各設(shè)6孔，每孔接種100 μl細(xì)胞懸液。置5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液。陰性對(duì)照組加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照組加入5% DMSO溶液，實(shí)驗(yàn)組加入試驗(yàn)樣品浸提液，每孔100 μl，置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h。更換培養(yǎng)液后的48 h，置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入20 μl質(zhì)量濃度為5 g／L的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入150 μl DMSO，置振蕩器上振蕩10 min，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值（吸光度值），按下式計(jì)算相對(duì)增殖率（RGR）。

式中：RGR—相對(duì)增殖率，%；A—供試品組吸光度；A0—陰性對(duì)照組吸光度。

根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定（陽(yáng)性對(duì)照組至少為3級(jí)反應(yīng)）。

樣品毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)≥100；1級(jí)，80～99；2級(jí)，50～79；3級(jí)，30～49；4級(jí)，0～29。樣品合格與否標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)和1級(jí)判為合格，2級(jí)結(jié)合形態(tài)分析綜合評(píng)價(jià)，3～4級(jí)者判為不合格：

1.2.2 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)：依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 16886.10進(jìn)行檢測(cè)［3］，實(shí)驗(yàn)分為兩組，樣品組：樣品和生理鹽水按照1∶5（w／w）在70℃下浸提24 h。陰性對(duì)照：同上方法制備不含被測(cè)樣品的0.9%氯化鈉注射液作為陰性對(duì)照液。選用兩只新西蘭兔，實(shí)驗(yàn)前一天，徹底去除動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)被毛，以備注射浸提液。在每只兔脊柱一側(cè)的前5個(gè)點(diǎn)使用1 ml注射器皮內(nèi)注射0.2 ml的樣品浸提液，同樣，在每只兔脊柱后5個(gè)點(diǎn)皮內(nèi)注射生理鹽水。注射后在24 h、48 h和72 h觀察記錄各注射部位情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，數(shù)目正常。陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞變圓，脫離培養(yǎng)孔，呈現(xiàn)漂浮狀。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，保持小鼠成纖維細(xì)胞的基本形態(tài)?？瞻讓?duì)照和陰性對(duì)照組的平均吸光度值都是0.84，而陽(yáng)性對(duì)照組只有0.18。實(shí)驗(yàn)組的增殖率為90.5%，按照細(xì)胞毒分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為1級(jí)，符合國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)觀察72 h表明，樣品浸提液組和生理鹽水組動(dòng)物皮膚反應(yīng)均無(wú)紅斑，水腫，產(chǎn)品材料等級(jí)評(píng)分為0，無(wú)刺激反應(yīng)，顯示材料對(duì)皮膚沒(méi)有潛在毒性。

3 討論

作為醫(yī)用高分子材料，除了要求無(wú)毒、不引起生物體病變，還要求材料對(duì)于生物體具有良好的組織相容性。羥乙基纖維素屬于纖維素衍生物的一種，是堿纖維素和環(huán)氧乙烷經(jīng)醚化反應(yīng)制備而成的白色或淡黃色無(wú)味無(wú)毒的纖維狀或粉末狀的非離子型水溶性纖維素醚［4］。該原料具有很多優(yōu)良的性質(zhì)，使其在工業(yè)方面得到廣泛的應(yīng)用：具有良好的水溶性，在冷水和熱水中均可溶解，對(duì)水和鹽水具有極強(qiáng)的親和力，穩(wěn)定性好，在酸性條件下也不會(huì)產(chǎn)生沉淀。羥乙基纖維素的主要用途是作為增黏劑來(lái)使用，能夠和水中的分散劑、高分子化合物發(fā)生作用使體系的黏度大幅度上升，其本身具有非離子型的特性，在水介質(zhì)中不會(huì)離子化，所以可以和許多水溶性的聚合物、表面活性劑、鹽共存，是含高濃度電解質(zhì)溶液的一種優(yōu)良的膠體增稠劑，并且對(duì)許多一價(jià)和二價(jià)的高濃度電解質(zhì)溶液有增稠作用。綜合以上內(nèi)容，羥乙基纖維素是一種十分優(yōu)良的增稠凝膠敷料基質(zhì)。

新型環(huán)保型高分子聚合物——聚六亞甲基單胍鹽酸鹽具有優(yōu)越的殺菌活性，屬于新一代的殺菌劑，其優(yōu)越性能主要體現(xiàn)在一下幾方面：（1）具有高效的殺菌能力，僅需少量添加就表現(xiàn)出優(yōu)異的殺菌性能，平均殺滅率99.9%。（2）安全系數(shù)高，無(wú)毒副作用，對(duì)皮膚黏膜、眼睛無(wú)刺激，體外細(xì)胞毒試驗(yàn)顯示細(xì)胞毒性小于1級(jí)。（3）作用時(shí)間持久，獨(dú)特的殺菌機(jī)理，不會(huì)引起細(xì)菌耐藥，長(zhǎng)久有效。（4）環(huán)境友好型殺菌劑，無(wú)色無(wú)味、不揮發(fā)、不含重金屬和酚類(lèi)物質(zhì)，對(duì)各類(lèi)處理表面無(wú)腐蝕。憑借這些優(yōu)越的性能，該類(lèi)殺菌劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、日用化學(xué)、紡織、造紙、水產(chǎn)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。在本產(chǎn)品中，胍鹽作為殺菌防腐劑顯示出卓越的性能。前期的微生物抑菌試驗(yàn)中，該產(chǎn)品對(duì)傷口中常見(jiàn)的諸如大腸桿菌、綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌都顯示出強(qiáng)大的殺滅效果，殺菌率達(dá)到了100%。

目前對(duì)于醫(yī)療器械材料的生物相容性評(píng)價(jià)方法包括動(dòng)物試驗(yàn)和體外試驗(yàn)，根據(jù)材料的性質(zhì)和作用部位的不同，使用不同的評(píng)價(jià)方法。目前來(lái)說(shuō)，被中國(guó)藥典和ISO收錄的方法有幾十種，但是中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB／T16886是國(guó)內(nèi)最權(quán)威的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)方法。根據(jù)產(chǎn)品的預(yù)期用途，對(duì)該傷口抑菌凝膠敷料進(jìn)行細(xì)胞毒和皮內(nèi)刺激等生物學(xué)評(píng)價(jià)，目的是為了預(yù)知和避免該材料應(yīng)用于人體后可能導(dǎo)致的不良反應(yīng)，為進(jìn)一步的臨床研究提供依據(jù)。

［1］程娟，柯軍，顏林.殼聚糖創(chuàng)傷敷料的生物學(xué)評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)醫(yī)療器械信息，2011，6（9）：40-42.

［2］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局GB16886.5-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［3］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局GB16886.10-2005醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分，刺激與遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［4］趙明，邵自強(qiáng)，敖玲玲.羥乙基纖維素的性能、應(yīng)用與市場(chǎng)現(xiàn)狀［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2013，10（2）：70-78.

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