張子健,江建梅,舒 媛,吳 振

(唐山拓普生物科技有限公司,唐山市生物工程技術(shù)研究中心,河北唐山 063000)

高核糖核酸啤酒酵母菌QH633菌體制備工藝優(yōu)化

張子健,江建梅,舒 媛,吳 振

(唐山拓普生物科技有限公司,唐山市生物工程技術(shù)研究中心,河北唐山 063000)

本文主要通過(guò)在搖床發(fā)酵條件下對(duì)啤酒酵母菌QH633的接種量、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),優(yōu)選最適參數(shù)范圍,再通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的發(fā)酵工藝為:發(fā)酵溫度28℃,接種量10.50%,轉(zhuǎn)速為203r/min,發(fā)酵時(shí)間16.5h,在此條件下,QH633的RNA含量為12.66%,與理論預(yù)測(cè)值基本符合,與初始發(fā)酵條件時(shí)的9.38%相比,增加了34.97%。

高核糖核酸酵母,工藝優(yōu)化,響應(yīng)面分析法,RNA含量

高呈味核苷酸酵母抽提物(Yeast Extract,簡(jiǎn)稱(chēng)YE),由于其低鹽、純天然、呈味性能優(yōu)良等特點(diǎn),逐漸被食品調(diào)味行業(yè)所青睞[1-2],該產(chǎn)品的制備要求原料具有較高的核糖核酸(RNA)含量。因此,如何提高酵母細(xì)胞中的RNA含量成為酵母深加工行業(yè)研究的熱門(mén)。

近些年來(lái),國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者對(duì)提高酵母菌體的RNA含量做了很多研究,也取得了一定的進(jìn)展[3-8],但是由于其研究目的大多以RNA提取為主,專(zhuān)門(mén)針對(duì)高呈味核苷酸YE開(kāi)發(fā)的研究較少；且研究?jī)?nèi)容主要集中在產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母等,這些菌株雖然RNA含量較高,但是并非對(duì)人體和動(dòng)物完全無(wú)毒副作用[9-12],而啤酒酵母,屬于釀酒酵母屬,被廣泛認(rèn)為是安全無(wú)公害的。本文主要針對(duì)高核糖核苷酸啤酒酵母的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,旨在為酵母的深加工提供可行性依據(jù),為啤酒酵母的綜合利用及新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:QH633(經(jīng)由唐山拓普生物科技有限公司誘變選育而得)。

材料:硫酸銨、葡萄糖、氯化鈉,磷酸二氫鉀、鹽酸、高氯酸,氯仿(均為分析純)；酵母抽提物(唐山拓普生物科技有限公司自主生產(chǎn))。

儀器:高壓蒸汽滅菌鍋BXM-30R 上海博訊；潔凈工作臺(tái) 上海博訊；高速冷凍離心機(jī) 賽默飛；全溫振蕩培養(yǎng)箱 榮華RH-Q；數(shù)顯恒溫水浴鍋 金怡HH-8；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 嘉程GC101；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯UV-2102C；電子天平；旋渦混合器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配方 經(jīng)前期正交實(shí)驗(yàn),確定培養(yǎng)基的最佳配方為:葡萄糖2%,硫酸銨2.50%,酵母浸膏0.50%,磷酸二氫鉀0.15%,氯化鈉1.0%,pH5.0。

1.2.2 菌體制備工藝中參數(shù)的優(yōu)化

1.2.2.1 接種量?jī)?yōu)化 按照接種量為5%、10%、15%、20%對(duì)QH633進(jìn)行接種,在28℃下,150r/min振蕩培養(yǎng)22h后,測(cè)定RNA含量、核酸總量和OD600nm值,優(yōu)選最適接種量。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度優(yōu)化 選取15、20、25、30℃四個(gè)不同的溫度,以1.2.2.1所得的最適接種量接種,150r/min振蕩培養(yǎng)22h,測(cè)定RNA含量、核酸總量和OD600nm值,優(yōu)選最適溫度。

1.2.2.3 發(fā)酵轉(zhuǎn)速優(yōu)化 在最適接種量、最適溫度下,轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100、150、200、250r/min,振蕩培養(yǎng)22h,測(cè)定RNA含量、核酸總量和OD600nm值,優(yōu)選最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

1.2.2.4 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化 在最適接種量、最適溫度和最適轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)12、14、16、18、20、22h測(cè)定RNA含量、核酸總量和OD600nm值,優(yōu)選最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)中挑選最適范圍,通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)QH633的培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化,以RNA含量為測(cè)定指標(biāo),確定QH633的最佳培養(yǎng)工藝。

表1 Box-Behnken因素水平編碼表Table 1 Experimental variables and levels for Box-Behnken design

1.2.3 測(cè)定方法

1.2.3.1 啤酒酵母RNA含量和核酸總量測(cè)定方法 使用高氯酸法[9],經(jīng)過(guò)改良。將發(fā)酵好的酵母菌離心,稀釋至3mL,并測(cè)定其固形物含量w,稱(chēng)取1.000±0.002g菌懸液到大試管中,加入10%的高氯酸5mL,置于100℃的水浴鍋中加熱30min,然后置于冰水中冷卻,以10000r/min離心20min。取上層的清液2mL,加入400μL氯仿,劇烈震蕩2min,10000r/min離心10min,吸取1mL上清液,加入到經(jīng)高溫滅菌的無(wú)菌水試管中稀釋至10-2梯度,旋渦混勻,以10%高氯酸為空白,在260nm下測(cè)核酸的吸光度。

酵母RNA含量(%)=(OD260/0.024×上清液體積×6)/(m×w)×100

核酸總量(mg/100mL)=(OD260/0.024×上清液體積×6×3)/1000

式中:0.024是濃度為1μg/mL的RNA溶液的OD值。

1.2.3.2 菌數(shù)的測(cè)定方法 將酵母懸液在600nm下測(cè)定吸光度值,OD600nm可反映菌株生長(zhǎng)情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003處理,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸和方差分析。p<0.05為差異顯著,p<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量

由圖1可知,QH633的RNA含量先隨接種量的提高而增加,接種量為10%時(shí),QH633的RNA含量達(dá)到最大值,為10.07%,隨接種量繼續(xù)提高,RNA含量反而降低,接種量20%時(shí)RNA含量?jī)H為8.73%。此外,接種量為10%時(shí),QH633菌數(shù)較為適中,發(fā)酵液的核酸總量較高,為8.49mg/100mL,因此,接種量控制在10%進(jìn)行接種發(fā)酵,其效果最佳。

圖1 QH633接種量?jī)?yōu)化Fig.1 Inoculation quantity optimization for QH633

2.2 溫度

由圖2可知,在15℃和20℃時(shí)進(jìn)行發(fā)酵,QH633的RNA含量分別為10.42%和11.15%,但是其菌體濃度太低,核酸總量?jī)H為1.95mg/100mL和2.79mg/100mL,不利于工業(yè)上的應(yīng)用生產(chǎn)；25℃進(jìn)行發(fā)酵時(shí),菌體RNA含量達(dá)到10.27%,菌體量增加明顯,核酸總量較高,為8.63mg/100mL；而30℃時(shí)的QH633的RNA含量?jī)H為8.72%,這有可能是因?yàn)闇囟葹?0℃時(shí),酵母細(xì)胞衰老加速,開(kāi)始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[10]。因此,25℃為最佳的發(fā)酵溫度。但是,由于在工業(yè)生產(chǎn)中普遍采用28℃和30℃作為酵母菌發(fā)酵的溫度,本研究中28℃時(shí)的RNA含量為10.07%(見(jiàn)2.1),更為接近最佳溫度,為更好地為工業(yè)化生產(chǎn)服務(wù),本文不再對(duì)溫度進(jìn)行優(yōu)化,均采用28℃為最適發(fā)酵溫度。

圖2 QH633溫度優(yōu)化Fig.2 Temperature optimization for QH633

2.3 轉(zhuǎn)速

由圖3可知,QH633的RNA含量先隨轉(zhuǎn)速的提高而增加,轉(zhuǎn)速控制在200r/min時(shí),QH633的RNA含量最高,為10.80%,這是由于轉(zhuǎn)速提升使得搖瓶中的溶氧量增加,菌體分裂增殖迅速,且可以避免產(chǎn)生對(duì)酵母生長(zhǎng)不利的乙醇。從而促進(jìn)了菌體中RNA的合成,而轉(zhuǎn)速為250r/min時(shí),RNA含量降為10.16%,這有可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)速過(guò)大,菌體間碰撞過(guò)于劇烈,導(dǎo)致細(xì)胞破損,RNA含量降低[7]。此外,轉(zhuǎn)速控制在200r/min時(shí),QH633菌數(shù)較為適中,核酸總量較高,為8.92mg/100mL,因此200r/min為發(fā)酵最佳轉(zhuǎn)速。

圖3 QH633轉(zhuǎn)速優(yōu)化Fig.3 Rotation rate optimization for QH633

2.4 時(shí)間

由圖4可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,QH633的RNA含量也逐漸增加,發(fā)酵16h時(shí),QH633的RNA含量最高,為12.11%,隨著發(fā)酵不斷進(jìn)行,RNA含量不斷降低,到22h時(shí),RNA含量降為10.72%。這可能是由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體進(jìn)行有絲分裂,RNA成雙倍出現(xiàn)在單個(gè)細(xì)胞中,此時(shí)的RNA含量最高,隨后細(xì)胞分裂,菌體數(shù)量增加,RNA含量則因分母的增加而降低,因此,發(fā)酵時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)[13]。此外,發(fā)酵16h時(shí),QH633菌數(shù)較為適中,核酸總量較高,為8.15mg/100mL,因此16h為發(fā)酵的最佳時(shí)間。

圖4 QH633時(shí)間優(yōu)化Fig.4 Time optimization for QH633

2.5 響應(yīng)面分析

參照文獻(xiàn)[14-15],利用Design Expert 8.0軟件,采用中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn),因素水平編碼表見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)共設(shè)17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),包括12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)中心點(diǎn),結(jié)果如表2所示。利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,經(jīng)回歸擬合后,各因素與響應(yīng)值的回歸方程為:

Y=12.53+0.18A+0.087B+0.49C-0.21AB-0.10AC+0.060BC-0.78A2-0.61B2-1.99C2

其中：Y-RNA含量(%)；A-接種量(%)；B-轉(zhuǎn)速(r/min)；C-時(shí)間(h)。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 方差分析表Table 3 ANOVA analysis for regression equation

根據(jù)方差分析和回歸方程,得到三維響應(yīng)曲面圖(圖5～7)?？疾焖鶖M合的響應(yīng)曲面的形狀,分析接種量、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間對(duì)RNA含量的影響。

通過(guò)模型預(yù)測(cè),QH633菌體富集RNA的最優(yōu)工藝為:接種量為10.50%,轉(zhuǎn)速203r/min,發(fā)酵時(shí)間16.5h,RNA含量預(yù)測(cè)值為12.57%。用優(yōu)化后的條件進(jìn)行了三次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),以保證預(yù)測(cè)值不偏離實(shí)際值,RNA含量平均為12.66%,實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值吻合良好,這表明模型能較好的預(yù)測(cè)實(shí)際RNA含量。

圖5 轉(zhuǎn)速和接種量對(duì)RNA含量影響的響應(yīng)曲線Fig.5 Response curve of rotation rate and inoculation quantity on the content of RNA

圖6 時(shí)間和接種量對(duì)RNA含量影響的響應(yīng)曲線Fig.6 Response curve of time and inoculation quantity on the content of RNA

圖7 時(shí)間和轉(zhuǎn)速對(duì)RNA含量影響的響應(yīng)曲線Fig.7 Response curve of time and rotation rate on the content of RNA

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)

原理以及響應(yīng)面分析法對(duì)啤酒酵母的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化,擬合了接種量、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)RNA含量的回歸模型,經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠,能較好的預(yù)測(cè)啤酒酵母的RNA含量,由該模型確定的最佳工藝條件為發(fā)酵溫度28℃,接種量10.5%、轉(zhuǎn)速203r/min、發(fā)酵時(shí)間16.5h。通過(guò)模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn),得到的因素主效應(yīng)關(guān)系為發(fā)酵時(shí)間>接種量>轉(zhuǎn)速。經(jīng)三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),RNA含量可達(dá)12.66%,相較初始發(fā)酵條件下的RNA含量9.38%,增加了34.97%。

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Optimization of cell preparation technology forhigh RNA content Beer Yeast QH633

ZHANG Zi-jian,JIANG Jian-mei,SHU Yuan,WU Zhen

(Tangshan TOP Bio-technology co.,ltd.,Tangshan Engineering Research Centre for Biological,Tangshan 063000,China)

In this paper,we studied the inoculation quantity,the fermentation temperature,the rotation rate and the fermentation time,as the single factor for QH633 fermentation experiment in shaking flask fermentation conditions. Then we selected the optimal parameters,and optimizated the fermentation process through the response surface analysis. The optimal fermentation conditions as follows:fermentation temperature 28℃,inoculation quantity 10.50%(v/v),revolution speed 203r/min,fermentation time 16.5h. Under this condition,the RNA content of QH633 was 12.66%,consistented with the predicted value,and compared with 9.38% of the initial fermentation conditions,increased by 34.97%.

high RNA content yeast;process optimization;response surface analysis;RNA content

2014-05-27

張子健(1984-)，女，碩士，工程師，研究方向：食品微生物。

國(guó)家國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(2012DFA30390)資助。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0178-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.028