任 萌,高國富,咸 漠,楊建明,3

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210095；2.中國科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實驗室,中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,山東青島 266101;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東青島 266109)

任 萌1,2,高國富1,*,咸 漠2,楊建明2,3

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210095；2.中國科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實驗室,中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所,山東青島 266101;3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東青島 266109)

為了提高α-蒎烯的產(chǎn)量,對YJM28菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化。通過單因素實驗篩選出了適合發(fā)酵α-蒎烯的最佳碳、氮源,分別為葡萄糖和蛋白胨。利用Design-Expert軟件設(shè)計Plackett-Burman實驗方案篩選出了影響α-蒎烯產(chǎn)量的3個重要因子；通過中心組和實驗及響應(yīng)面分析法確定了3個因子的最佳濃度:微量元素溶液63.78μL/100mL,蛋白胨9g/L,葡萄糖2.77g/L。用優(yōu)化后的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)α-蒎烯,48h后的α-蒎烯產(chǎn)量達(dá)33.26mg/L,比優(yōu)化前提高了6.75倍。

α-蒎烯,培養(yǎng)基優(yōu)化,響應(yīng)面,重組大腸桿菌

α-蒎烯主要存在于松木中,作為松樹分泌物的一種化學(xué)物質(zhì),對松樹病蟲防治有重要作用。α-蒎烯(2,6,6-三甲基雙環(huán)(3.1.1)-2-庚-2-烯)是萜烯類物質(zhì)的衍生物,廣泛用于香料合成,潤滑劑及航空燃料等領(lǐng)域[1-4]。目前α-蒎烯工業(yè)生產(chǎn)主要來源于松節(jié)油餾分[3]。然而森林資源總量有限,原料短缺成為α-蒎烯工業(yè)化生產(chǎn)的瓶頸。因此,尋找新的可再生替代來源顯得日益重要,其中利用微生物轉(zhuǎn)化獲得α-蒎烯是極具吸引力的新途徑[4]。響應(yīng)面法作為一種傳統(tǒng)的統(tǒng)計學(xué)方法[5],其作用是能夠行之有效的優(yōu)化生物過程,獲得生物過程的最佳條件[6],近年來已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[7-8]。2013年,楊建明等人成功構(gòu)建了可以合成α-蒎烯的重組大腸桿菌[9],之后,Pamela Peralta-Yahya和她的研究團(tuán)隊將來自6種植物,而且是最活躍的兩個蛋白基因(GPPS和PS)克隆到大腸桿菌中,使其可通過自身代謝并最終轉(zhuǎn)換成蒎烯,可獲得28mg/L的蒎烯產(chǎn)量[10]。

本文用重組大腸桿菌YJM28作為生產(chǎn)菌種,通過系統(tǒng)的優(yōu)化培養(yǎng)基大幅度增加了產(chǎn)量為實現(xiàn)α-蒎烯的工業(yè)化應(yīng)用提供了支持。從發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化角度提高重組大腸桿菌生產(chǎn)α-蒎烯產(chǎn)量在國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)中至今報道較少。

表2 基于CCD的響應(yīng)面實驗設(shè)計變量水平Table 2 Experimental range and levels of the independent variables in RSM based CCD

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組E.coliYJM28,由質(zhì)粒pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-pt30和pTRC-low(含有片段IDI 1、ERG 8、ERG 12、ERG 19)共轉(zhuǎn)獲得,中科院青島生物能源與過程研究所,生物基化學(xué)品團(tuán)隊實驗室構(gòu)建及保存；種子培養(yǎng)基 蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,NaCl 10g/L,氨芐青霉素100mg/L,霉霉素34mg/L；

初始發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖2g/L,牛肉粉9g/L,三水合磷酸氫二鉀 9.8g/L,一水合檸檬酸6.3g/L,檸檬酸鐵銨0.3g/L,硫酸鎂溶液 2mmol/L；發(fā)酵培養(yǎng)基 用時添加34mg/L氯霉素和100mg/L氨芐青霉素。

Cary-50紫外-可見分光光度計 美國瓦里安技術(shù)有限公司；SP-6890氣相色譜儀 山東魯南瑞紅化學(xué)分析儀器有限公司；IS-RDS3型恒溫振蕩器 美國CRYSTAL公司；1-14臺式高速離心機(jī) 美國Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基優(yōu)化方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 挑取單克隆于3mL LB培養(yǎng)液,37℃,180r/min搖床培養(yǎng)8～12h后,1mL種子培養(yǎng)基接入裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的590mL厭氧瓶中,37℃,180r/min培養(yǎng)至 OD600達(dá)到0.6～0.9,加入IPTG溶液誘導(dǎo),誘導(dǎo)后培養(yǎng)溫度調(diào)至30℃,發(fā)酵48h[11]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 氮源實驗 以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別添加相同質(zhì)量濃度(9g/L)的牛肉粉、牛肉膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、尿素作為氮源進(jìn)行α-蒎烯發(fā)酵實驗,條件如1.2.1,發(fā)酵后48h測定α-蒎烯濃度。

1.2.2.2 碳源實驗 分別用相同質(zhì)量濃度(2g/L)的蔗糖、木糖、果糖、麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、乙酸鈉和葡萄糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵實驗,條件如1.2.1,發(fā)酵后48h測定α-蒎烯濃度。

1.2.3 P-B實驗 Plackett-Burman實驗設(shè)計法,是兩水平部分因子實驗,用最少的實驗次數(shù)估計出因素的主次,以從眾多的考察因素中快速有效的篩選出最為重要的因素進(jìn)行下一步研究。根據(jù)之前的實驗結(jié)果設(shè)計P-B實驗,實驗次數(shù)N=15,以48h后產(chǎn)物α-蒎烯濃度為響應(yīng)值。因素及水平表見表1,實驗設(shè)計矩陣見表3。

1.2.4 響應(yīng)面分析 采用Central-Composition法[14]。依據(jù)Central-Composition中心旋轉(zhuǎn)設(shè)計原理,設(shè)計三因素五水平的響應(yīng)面分析實驗[8]。實驗設(shè)計矩陣中包含三類實驗點(diǎn),析因點(diǎn)、零點(diǎn)以及星點(diǎn)。析因點(diǎn)由自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維定點(diǎn),共8組；零點(diǎn)用來估計實驗誤差用,由區(qū)域的中心點(diǎn)構(gòu)成,共6組；星點(diǎn)用于校正擬合曲面,使之能更好的對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行三維擬合,從而得到擬合方程,共8組[15-16]。因素水平表見表2,實驗設(shè)計矩陣見表3,非顯著因素選擇水平根據(jù)P-B實驗結(jié)果確定,效應(yīng)為正,則選擇高濃度,反之,則選擇低濃度。

表1 P-B實驗設(shè)計因素水平表Table 1 Levels of variables for Packett-Burman experiment

1.2.5 α-蒎烯檢測及菌濃測定 發(fā)酵結(jié)束將搖瓶放入60℃控溫箱處理30min,頂空抽取1mL氣體進(jìn)行氣相色譜檢測,以α-蒎烯標(biāo)準(zhǔn)品作為定量標(biāo)準(zhǔn)。使用SP-6890氣相色譜儀,色譜柱為HP-Innowax色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm),檢測器為火焰離子化檢測器;氣化室溫度200℃,柱室溫度50℃保溫0.5min,然后4℃/min升溫至70℃,再以20℃/min升溫至250℃,保溫5min,檢測器溫度200℃[12-13]。用分光光度計在600nm波長測定菌體濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源篩選結(jié)果

氮源篩選結(jié)果如圖1。

圖1 氮源篩選結(jié)果圖,橫坐標(biāo)表示不同的氮源, 縱坐標(biāo)代表產(chǎn)物的氣相峰面積Fig.1 Result of screening nitrogen source注:1,2,3,4,5,6,7,8分別代表奧博酵母粉、MD牛肉粉、 Solarbio牛肉膏、國藥大豆蛋白胨、大茂蛋白胨、 氯化銨(國藥)、硫酸銨(國藥)、尿素(國藥)。

根據(jù)圖1的實驗結(jié)果,在五種有機(jī)氮源和三種無機(jī)氮源中蛋白胨是優(yōu)選的氮源。正如圖1所示,有機(jī)氮源效果明顯要比無機(jī)氮源好很多。48h內(nèi),無機(jī)氮源沒有產(chǎn)物α-蒎烯的累積；有機(jī)氮源中,蛋白胨的發(fā)酵效果明顯優(yōu)于其他組。在發(fā)酵的菌體生長階段,蛋白胨實驗組菌濃達(dá)到誘導(dǎo)要求所需的培養(yǎng)時間大約3h,而酵母粉和牛肉粉實驗組大約4h,縮短約1h。在發(fā)酵后期,蛋白胨組菌體正常,不發(fā)生自溶；酵母粉和牛肉粉實驗組后期發(fā)酵液當(dāng)中黏度增大,細(xì)胞形態(tài)拉長,造成菌體生長異常。因此選用蛋白胨作為優(yōu)選氮源進(jìn)行下一步實驗。

2.2 碳源篩選結(jié)果

將蛋白胨作為氮源,葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等8種作為待選碳源進(jìn)行篩選,篩選結(jié)果如圖2所示。

圖2 碳源篩選結(jié)果Fig.2 Result of screening carbon source注:1,2,3,4,5,6,7,8分別代表蔗糖、木糖、果糖、 麥芽糖、甘油、可溶性淀粉、乙酸鈉和葡萄糖。

根據(jù)圖2所知,葡萄糖作為α-蒎烯發(fā)酵的碳源較好。對產(chǎn)物提高貢獻(xiàn)大小依次為:葡萄糖>麥芽糖>甘油、乙酸鈉、淀粉>蔗糖、木糖和果糖。麥芽糖、蔗糖作為二糖,微生物不能直接利用,需要水解為單糖后為微生物利用。葡萄糖組在發(fā)酵前期菌體生長速率正常,能夠保證在后期菌體能夠合成產(chǎn)物α-蒎烯,發(fā)酵液粘度正常,細(xì)胞形態(tài)也沒有出現(xiàn)異常,發(fā)酵后期沒有發(fā)生菌體自溶,說明葡萄糖實驗組是首選的碳源。麥芽糖組前發(fā)酵期出現(xiàn)發(fā)酵液發(fā)粘,培養(yǎng)基當(dāng)中傳質(zhì)速率下降,菌體生長困難。乙酸鈉是一種強(qiáng)堿弱酸鹽,在水中能分解出少量乙酸,抑制微生物的生長,用它作為微生物發(fā)酵的碳源,實驗組從接菌到誘導(dǎo)的時間由原來的3h左右提高到7h左右,增加了菌體的發(fā)酵周期。其他候選組對α-蒎烯的產(chǎn)物合成提高貢獻(xiàn)不大,因此暫時不考慮。綜上所述,將葡萄糖作為優(yōu)選后的碳源進(jìn)行后續(xù)的單因素及正交實驗。

2.3 P-B實驗結(jié)果

P-B實驗采用N=15的實驗設(shè)計表,對8個因素進(jìn)行考察,每個因素各選取高低兩個水平,以發(fā)酵結(jié)束后α-蒎烯的氣相色譜峰面積作為響應(yīng)值,實驗設(shè)計及結(jié)果見表3,P-B實驗結(jié)果的回歸分析見表4。

表3 P-B實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and result of P-B experiment

表4 P-B實驗設(shè)計因素水平及效應(yīng)分析Table 4 Analysis of the effect for Packett-Burman experiment

注：R2=0.9196；調(diào)整R2=0.9107；**表示在α=0.01水平上對結(jié)果影響顯著的重要因素；*表示在α=0.05水平上對結(jié)果影響顯著的重要因素；其他是在α=0.05水平上對結(jié)果影響不顯著的非重要因素。

利用Design-Expert對表3中的結(jié)果建立多元一次回歸模型,分析結(jié)果見表4。由表4可知,所建立的模型p值是0.0222,說明模型有2.22%的可能性被噪聲影響,該模型結(jié)果可靠。實驗因素葡萄糖、蛋白胨、微量元素溶液的p值分別是0.0037、0.0416、0.0223,均小于0.05,其他因素的p值大于0.05,因此,葡萄糖、蛋白胨、微量元素溶液對產(chǎn)物產(chǎn)量影響顯著。8種因素對響應(yīng)值有正效應(yīng)的有:葡萄糖、硫酸鎂溶液、微量元素溶液、IPTG溶液；對響應(yīng)值有負(fù)效應(yīng)的有:蛋白胨、檸檬酸鐵銨、磷酸氫二鉀、檸檬酸。所以,要想增加α-蒎烯產(chǎn)量,需要增加正效應(yīng)因素的濃度,反之,則需要減少。

2.4 關(guān)鍵培養(yǎng)基濃度的最優(yōu)化

由單因素實驗確定顯著及非顯著因素的水平,再采用中心組合設(shè)計實驗對葡萄糖、蛋白胨以及微量元素溶液這3個因素進(jìn)行基于CCD實驗設(shè)計的響應(yīng)面分析,實驗結(jié)果見表5。

表5 中心組合設(shè)計矩陣及實驗結(jié)果Table 5 Design and results of central composition design

表6 中心組合設(shè)計二次回歸模型方差分析及回歸分析Table 6 Regression Analysis and ANOVA for the quadratic regression model obtained from CCD

注：R2=0.9268；**表示在α=0.05水平上對結(jié)果影響顯著的重要因素；*表示在α=0.05水平上對結(jié)果影響顯著的重要因素；其他是在α=0.05水平上對結(jié)果影響不顯著的非重要因素。 利用Design-Expert 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,三元二次回歸擬合方程如下:Y=25502.71+4653.314A+5890.257B+256.4958C+5486.009AB-156.934AC+256.7286BC-6562.79A2-4917.23B2-5768.86C2

其中,Y是產(chǎn)物α-蒎烯的氣相峰面積；A,B和C分別代表葡萄糖,蛋白胨,微量元素溶液濃度。

對以上方程進(jìn)行回歸分析,分析結(jié)果見表6。通過表6知,三種顯著因素對產(chǎn)物產(chǎn)量的影響大小順序依次是:蛋白胨>葡萄糖>微量元素溶液。所建立模型的p=0.0098<0.01,說明此模型在α=0.01水平差異顯著。模型失擬項p=0.9533>0.5,說明模型的選擇比較恰當(dāng)；相關(guān)系數(shù)R2=0.9268>0.9,說明擬合良好。以上表明,選擇的模型能夠?qū)Ζ?蒎烯的發(fā)酵優(yōu)化實驗進(jìn)行較為精確的預(yù)測和分析。

對實驗結(jié)果用Design-Expert7.0軟件分析,分析結(jié)果見表6。

利用Design-Expert對表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行曲面擬合,結(jié)果見圖3。擬合后形成的曲面分為三類,一種是“凸”形圖,該種圖形的康托爾圖是等高線圖,存在極大值點(diǎn)；還有一種是“凹”形圖,該種圖形的康托爾圖也是等高線圖,存在極小值點(diǎn)；最后一種是“馬鞍”形,該圖的康托爾圖是雙曲線形,不存在極值點(diǎn)。通過圖3可知,葡萄糖和蛋白胨交互作用顯著,葡萄糖和微量元素溶液添加量、蛋白胨和微量元素溶液添加量交互作用不顯著。采用軟件對擬合圖形進(jìn)行分析可知,三張曲面圖都是“凸”形圖,存在極大值點(diǎn),說明建立模型的擬合方程存在穩(wěn)定點(diǎn)(極大值點(diǎn))[17]。對模型進(jìn)行嶺嵴分析[18](ridge analysis),得到極大值點(diǎn)所對應(yīng)因素的預(yù)測值分別是:葡萄糖,蛋白胨和微量元素溶液各個用量為2.77,9g/L,63.78μL/100mL,此時方程存在極大值點(diǎn),預(yù)測響應(yīng)值是30553.22,依據(jù)線性方程Y=44.721X+36.779(Y代表產(chǎn)物氣相峰面積,X代表產(chǎn)物濃度,單位μg/L),所對應(yīng)α-蒎烯濃度是33.44mg/L。

圖3 葡萄糖,蛋白胨,微量元素溶液響應(yīng)面分析曲面圖Fig.3 The response surface plot and contour plots for the effects of glucose(A)and peptone(B) and trace element solution(C)

2.5 驗證實驗

為了驗證回歸模型的可信性,用上述的優(yōu)化條件進(jìn)行菌株YJM28產(chǎn)α-蒎烯的發(fā)酵實驗,3次重復(fù),所得α-蒎烯的產(chǎn)量分別為33.58、31.84、34.36mg/L,3次重復(fù)的平均值為33.26mg/L。實驗值與模型的預(yù)測值基本一致,可見該模型能較好的預(yù)測實際發(fā)酵產(chǎn)α-蒎烯的情況。通過培養(yǎng)基組分優(yōu)化,菌株YJM28發(fā)酵α-蒎烯產(chǎn)量從4.28mg/L提升至33.26mg/L,提高了6.75倍。

3 結(jié)論與討論

通過實驗篩選出了對重組工程大腸桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化起重要作用的葡萄糖,蛋白胨,微量元素溶液三種組分,并確定了最佳濃度。最終確定培養(yǎng)基的最佳配比是:葡萄糖 2.77g/L,蛋白胨 9g/L,微量元素溶液 63.78μL/100mL,IPTG濃度 0.04mmol/L,檸檬酸鐵銨 0.15g/L,MgSO4溶液 8mmol/L,三水合磷酸氫二鉀 4.9g/L,一水合檸檬酸 0.525g/L,α-蒎烯產(chǎn)量從4.28mg/L提高到33.26mg/L,與初始的發(fā)酵培養(yǎng)基相比提高了675.21%。

本研究對重組大腸桿菌YJM28的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。利用單因素實驗確定了葡萄糖、蛋白胨以及微量元素溶液添加量對α-蒎烯的產(chǎn)物濃度有重要影響。葡萄糖作為有機(jī)碳源,增加用量一方面能夠增加菌體生長速度,增加產(chǎn)物合成速度；另一方面,隨著葡萄糖用量的增加,培養(yǎng)基的粘度增大,傳質(zhì)速率下降,造成發(fā)酵液當(dāng)中的溶氧降低,阻礙了菌體的生長。蛋白胨作為有機(jī)氮源,增加用量一方面促進(jìn)菌體生長,增加產(chǎn)物合成；另一方面,在產(chǎn)物合成后期,菌體生長過盛,造成發(fā)酵液黏度增高,溶氧降低,反而抑制了菌體生長,造成菌體提前衰老,菌體發(fā)生自溶。微量元素溶液是由錳、鋅、銅、鐵、鈷等微量元素的水合鹽配制成的鹽溶液,含有多種菌體生長所必須的金屬元素。微生物當(dāng)中的酶,其活性中心都含有金屬元素的催化中心,增加金屬元素的含量,能夠迅速增加酶的活性,使酶的活性得到成倍提高,從而提高了產(chǎn)物的合成速率。另一方面,增加微量元素溶液的用量,提高了銅、鋅等金屬元素在發(fā)酵液當(dāng)中的濃度,對菌體細(xì)胞造成了一定的毒性,使菌體發(fā)生生長延滯甚至停止生長。因此,從對細(xì)胞生長及產(chǎn)物合成的重要性來講,微量元素溶液對細(xì)胞生長重要,但是用量對菌體產(chǎn)物合成影響不是很大,而蛋白胨和葡萄糖則是菌體生長所必須的碳、氮源,增加用量,則能夠快速的促進(jìn)產(chǎn)物合成以及細(xì)胞的增長,這與通過回歸模型的分析得到的結(jié)論相吻合。

本文報道從培養(yǎng)基優(yōu)化的角度提高了重組工程大腸桿菌產(chǎn)α-蒎烯的產(chǎn)量,對后續(xù)放大以及大規(guī)模生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。

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Optimization of medium for the production of α-pineneby the recombinantEscherichiacoli

REN Meng1,2,GAO Guo-fu1,*,XIAN Mo2,YANG Jian-ming2,3

(1.School of Life and Sciences,Nan Jing Agricultural University,Nanjing 210095,China；2.CAS Key Laboratory of Bio-based Material,Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266101,China;3.School of Life and Sciences,Qing Dao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

In order to improve the yield of alpha-pinene,optimization of the fermentation medium for strain YJM28 was carried out by response surface analysis. The optimal carbon and nitrogen source for YJM28 were glucose and peptone,respectively. Three most important substrates for YJM28 were screened via Plackett-Burman experiments and using Design-Expert software. Optimal concentrations of the three substrates were confirmed by Central-Composed design and response surface analysis. The results were 63.78μL/100mL of trace element solution,2.77g/L of glucose and 9g/L of peptone. Fermented with the optimized medium,the yield of alpha-pinene after 48h reached 33.26mg/L,increased by 6.75-fold compared with the original medium.

α-pinene;medium optimization;response surface;recombinantE.coli

2014-03-06

任萌(1988-)，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

*通訊作者:高國富(1963-)，男，碩士，副教授，研究方向：動物活性物質(zhì)、動物資源。

國家自然科學(xué)基金(21206185；21376255)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(SS2013AA050703-2)；國家科技支撐計劃重大項目(2012BAD32B06-2)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)03-0151-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.023