耿 蕊,劉繼超

(1.北京市育才學(xué)校,北京 100050；2.北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法快速檢測(cè)沙門氏菌

耿 蕊1,劉繼超2,*

(1.北京市育才學(xué)校,北京 100050；2.北京三元食品股份有限公司,北京 100163)

為建立檢測(cè)沙門氏菌的快速、特異、靈敏的熒光定量PCR方法,以沙門氏菌invA基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物,并進(jìn)行特異性、靈敏度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,建立的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)沙門氏菌的方法具有極強(qiáng)的特異性,其中沙門氏菌檢出限為86copies/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999,擴(kuò)增效率為104%,不同濃度質(zhì)粒重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)均<3%,符合WHO對(duì)中等實(shí)驗(yàn)室提出的標(biāo)準(zhǔn)(CV 3%),顯示了良好的重復(fù)性。結(jié)果表明該方法具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)管、商品檢驗(yàn)檢疫以及臨床診斷等領(lǐng)域。

SYBR GreenⅠ,熒光定量PCR,沙門氏菌

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌,是常見的人畜共患的腸道致病菌,也是引起食物中毒最常見的致病菌[1],其廣泛分布于自然界中,是食品安全領(lǐng)域重點(diǎn)監(jiān)控的病原菌,對(duì)人類和動(dòng)物健康具有極大危害[2]。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)沙門氏菌的方法很多,主要有金標(biāo)試紙法、自動(dòng)酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)(VIDAS)篩選法、快速酶促反應(yīng)顯色培養(yǎng)基法、DNA探針技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)[3-7]。以上方法不同時(shí)具備快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、適用范圍廣以及操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),很難滿足當(dāng)前快速檢測(cè)要求[8-9]。熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)克服了以上檢測(cè)方法的缺點(diǎn),在眾多現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)中脫穎而出,成為檢測(cè)領(lǐng)域中越來越重要的一種快速檢測(cè)手段[10]。

本研究使用SYBR Green(染料法熒光定量PCR技術(shù),針對(duì)編碼沙門氏菌吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白invA基因設(shè)計(jì)特異性引物,建立了檢測(cè)沙門氏菌的熒光定量PCR方法,可應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)管、商品檢驗(yàn)檢疫以及臨床診斷等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)菌株單增李斯特菌(ATCC-15313)、大腸桿菌(ATCC-25922)、金黃色葡萄球菌(CGMCC-1.0128)、沙門氏菌(CGMCC-1.1552)、表皮葡萄球菌(CGMCC-1.2429) 分別購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

熒光定量PCR擴(kuò)增儀7500 美國(guó)ABI公司；熒光定量PCR反應(yīng)體系中各試劑 均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genebank公布的沙門氏菌吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白invA基因序列,通過BLAST比對(duì)找出沙門氏菌特異的基因序列,采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物,上游引物:5′-GTGAAATAATCGCCACGTTCGGGCAA-3′,下游引物:5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3′,擴(kuò)增片段大小為284bp,由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 模板DNA的提取 在無菌條件下,用滅菌處理的接種環(huán)分別挑取實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌落,接種于5mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜后培養(yǎng)基出現(xiàn)明顯混濁,即培養(yǎng)基中有大量菌體增殖。使用培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行沙門氏菌基因組DNA的提取,提取菌體DNA方法見參考文獻(xiàn)[11-12]。

1.2.3 引物的特異性實(shí)驗(yàn) 對(duì)提取的所有細(xì)菌基因組DNA分別進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),其中沙門氏菌(CGMCC-1.1552)作為陽性對(duì)照菌株,其他致病菌作為陰性菌株來檢驗(yàn)引物的特異性。熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10s；95℃變性5s,60℃退火34s,循環(huán)40次；在60℃退火34s階段收集熒光值,并在上述擴(kuò)增條件后增加60℃至95℃的融解曲線分析步驟。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的制備 以沙門氏菌基因組為模板,利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的基因片段。反應(yīng)體系為:模板1μL,上游引物0.5μL(25μmol/L),下游引物0.5μL(25μmol/L),10×擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液2μL,PCR染料2μL,dNTPs 0.5μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,無菌超純水13μL,總體積為20μL,混勻后置PCR儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng),循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性3min,95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳,TaKaRa瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收條帶,連接到pGM19-T載體上,并導(dǎo)入到JM109感受態(tài)細(xì)胞中,37℃培養(yǎng)過夜,進(jìn)行藍(lán)白篩選,挑取陽性克隆,由寶生物工程(大連)公司進(jìn)行測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。采用質(zhì)粒試劑盒抽提重組質(zhì)粒,按一定倍數(shù)稀釋后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260nm下的OD值,計(jì)算其拷貝數(shù)(copies/mL)。拷貝數(shù)=50(g/mL)×10-6×OD×6.02×1023/660(道爾頓/堿基)×擴(kuò)增堿基數(shù)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及靈敏度的確定 SYBR Green Ⅰ染料法的反應(yīng)體系按照大連寶生物熒光定量PCR(TaKaRa Premix Ex TaqTM)說明書操作。循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性10s；95℃變性5s,60℃退火34s,循環(huán)40次；在60℃退火34s階段收集熒光值,并在上述擴(kuò)增條件后增加60～95℃的融解曲線步驟。

將質(zhì)粒按10倍梯度稀釋,稀釋后溶液分別作為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,確定熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及靈敏度。

1.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分析 取3種不同濃度沙門氏菌重組質(zhì)粒,經(jīng)重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),觀察沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系的重復(fù)性效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌基因組DNA的提取

使用1.2.2的方法提取沙門氏菌基因組DNA,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的沙門氏菌DNA,結(jié)果見圖1,電泳結(jié)果良好。

圖1 沙門氏菌基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Results of DNA electrophoresis of Salmonella spp. Genome注:1,2.基因組DNA；M.100bp Marker。

2.2 熒光定量PCR引物的特異性實(shí)驗(yàn)

invA 基因位于沙門氏菌毒力島1,編碼類型Ⅲ分泌系統(tǒng)蛋白(一種多面體內(nèi)膜蛋白,與致病力相關(guān))[13]。以不同菌株基因組模板進(jìn)行熒光定量分析,只有沙門氏菌基因組模板有典型的熒光擴(kuò)增曲線,大腸桿菌、表皮葡萄球菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌與陰性對(duì)照均無熒光擴(kuò)增曲線,熒光擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示,其溶解曲線見圖3所示,表明該法檢測(cè)沙門氏菌具有良好的特異性。

圖2 熒光PCR引物特異性Fig.2 Specific curves of fluorescence PCR primers注:invA.陽性擴(kuò)增曲線；NO invA.因陰性擴(kuò)增曲線,圖3同。 圖2和圖3中不同的曲線代表針對(duì)inv基因的多次重復(fù) 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,顯示了良好的重復(fù)性。

圖3 SYBR Green I溶解曲線Fig.3 Melting curves of SYBR Green I

2.3 轉(zhuǎn)化質(zhì)粒鑒定

使用invA基因的特異性引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增的結(jié)果見圖4,然后利用TaKaRa瓊脂凝膠提取試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收,以回收的目的片段為模板進(jìn)行克隆,進(jìn)行藍(lán)白篩選,液體培養(yǎng)提取質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果證明擴(kuò)增片段與數(shù)據(jù)庫中序列完全相符,所以認(rèn)為成功轉(zhuǎn)入了PCR產(chǎn)物。

圖4 invA基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.4 Results of electrophoresis of the invA gene PCR amplification注:M:100bp Marker；1:invA基因的擴(kuò)增結(jié)果。

2.4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及靈敏度確定

用1.2.4方法公式計(jì)算后得出轉(zhuǎn)化質(zhì)粒溶液的濃度為8.6×1012copies/mL,將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒溶液按10倍梯度稀釋,使用稀釋后溶液分別作為模板,進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,以各標(biāo)準(zhǔn)模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo),以其對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo),建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5,擴(kuò)增曲線見圖6,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.645x+31.54,R2=0.999,Eff%=104%,得出該方法的靈敏度為86copies/mL。

圖5 invA基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curves of invA gene amplification

圖6 熒光PCR擴(kuò)增曲線圖Fig.6 Amplification curves of fluorescence PCR

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分析

對(duì)108、107和106copies/mL濃度沙門氏菌重組質(zhì)粒進(jìn)行重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn),測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,分析結(jié)果見表1,不同濃度質(zhì)粒重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)Ct值變異系數(shù)分別為0.2%、0.06%、0.07%,可見,Ct值的變異系數(shù)均<3%,符合WHO對(duì)中等實(shí)驗(yàn)室提出的標(biāo)準(zhǔn)(CV3%),顯示了良好的重復(fù)性。

表1 不同濃度質(zhì)粒重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)Ct值變異系數(shù)Table 1 Different concentrations of plasmid repetitive amplification test Ct value of coefficient of variation

3 結(jié)論與討論

本研究以沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的invA基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物,建立了SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)沙門氏菌的方法具有極強(qiáng)的特異性,其中沙門氏菌檢出限為86copies/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.645x+31.54,相關(guān)系數(shù)R2為0.999,擴(kuò)增效率為104%,不同濃度質(zhì)粒重復(fù)性擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)均<3%,顯示了良好的重復(fù)性?？梢?本研究所建立的快速檢測(cè)沙門氏菌的熒光定量PCR方法,靈敏度高于傳統(tǒng)PCR,并且更易于自動(dòng)化,具有快速、簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于食品衛(wèi)生監(jiān)管、商品檢驗(yàn)檢疫以及臨床診斷等領(lǐng)域,簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程、縮短了檢測(cè)時(shí)間,為食品污染的監(jiān)測(cè)和食物中毒事件的快速反應(yīng)提供了技術(shù)支持,也必將為保障消費(fèi)的生命健康、服務(wù)經(jīng)濟(jì)建設(shè)發(fā)揮重要作用。

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Rrapid detection ofSalmonellaspp. bySYBR Green I real-time polymerase chain reaction

GENG Rui1,LIU Ji-chao2,*

(1.Bei Jing Yu Cai School,Beijing 100050,China；2.Beijing Sanyuan Foods Co.,Ltd.,Beijing 100163,China)

According to the invA gene ofSalmonellaspp.,a pair of primers was designed to establish a real-time PCR. The rapid,specific,sensitive detection ofSalmonellaspp. was achieved,and the evaluation of detection sensitivity,specificity and repeatability was carried out. This method had good specificity. The limit of detection of the method was 86copies,correlation coefficient of the standard curve was 0.999 and amplification efficiency was 104%. Different concentrations of plasmid repetitive amplification coefficients of variation were less 3%,accord with standard preferred for moderately laboratory by WHO,indicating a good reliability. The SYBR Green I real-time PCR detection technology was rapid,simple,specific,and sensitive,which may be widely applied in the detection ofSalmonellaspp. in the field of food sanitation supervision,commodity inspection and detection,clinical diagnosis,etc.

SYBR Green I;real-time PCR;Salmonellaspp

2014-05-27

耿蕊(1971-)，女，本科，中教一級(jí)，研究方向:微生物學(xué)。

國(guó)家“十二五”支撐計(jì)劃(2012BAD12B06)；國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2012GA600001)。

TS201.3

B

1002-0306(2015)03-0147-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.022

*通訊作者:劉繼超(1983-)，碩士，工程師，主要從事乳品質(zhì)量安全方向研究工作